ICS65.020.010 B16 中华人民共和国国家标准 GB/T31793—2015 油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofLeptosphaeriamaculans(Fuckel)Ces.etDeNot. 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会发布前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:吴品珊、易建平、周国梁、杜洪忠。 ⅠGB/T31793—2015 油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法 1 范围 本标准规定了油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于油菜和油菜茎基溃疡病菌其他十字花科寄主种子和植株中油菜茎基溃疡病菌的检疫 和鉴定。 2 仪器和用具 2.1 仪器 电子天平(感量0.01g)、生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、高压灭菌 锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、实时荧光PCR仪、培养箱、冰箱。 2.2 用具 烧杯、三角瓶、量筒、培养皿、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、接种针、载玻片、盖玻片、研钵、移液器、移 液器吸头、离心管、液氮罐、孔径2.5mm和1.5mm的网筛。 3 试剂和培养基 3.1 试剂 1.0%次氯酸钠(NaClO),琼脂粉,马铃薯,葡萄糖,乳酸,琼脂糖,无菌双蒸水,液氮,蛋白胨,磷酸二 氢钾,硫酸镁,链霉素,新霉素,五氯硝基苯,氯四环素,利福平,Tris-HCl,MgCl2,HCl,EDTA,NaOH, NaOAc,KCl,Tris,CTAB,TAE,无水乙醇(ethanol),苯酚(phenol),溴化乙锭(EB),三氯甲烷(chloro- form),异丙醇(isopropanol),异戊醇(isoamylalcohol),蛋白酶K,TaqDNA聚合酶,dNTP,DNA相对 分子质量标准物,PCR特异性引物和实时荧光PCR特异性引物及探针。 3.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),酸性马铃薯葡萄糖琼脂培养基(APDA)。具体配方参见附录A。 4 检疫鉴定方法 4.1 种子检测 未带有种衣剂的种子,解剖镜下挑取皱缩、干瘪、变色、畸形、残缺或有霉变的种子1g~2g;带有种 衣剂的种子,先用自来水浸泡洗去种衣剂,或用纱布包裹浸泡搓洗种子,自来水冲洗去种衣剂,待风干后 挑取异常种子,做分离培养。 商用油菜籽样品取1kg,用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛,孔径2.5mm筛上物多为豆荚和 茎等植株残体,孔径1.5mm筛下物多为碎屑和细小油菜籽。筛上物和筛下物混匀后,取1g~2g制 样,进行PCR初检,初检如果阳性,再挑取异常种子做分离培养。 1GB/T31793—2015 4.2 植株症状检查 检查植物的根、茎和叶片等部位,对茎部溃疡黑斑、根部变色黑腐、叶上有灰色斑点的植物,取样送 实验室做进一步检验。油菜茎基溃疡病菌为害症状参见附录A。 4.3 分离培养 种子样品用无菌水室温浸泡0.5h~1h;无菌水洗涤3次后加入无菌水浸泡,置于20℃~25℃培 养1d;无菌水洗涤3次后转入-20℃下冷冻处理过夜;1%次氯酸钠消毒10min,无菌水3次洗涤后置 于APDA培养基上,30粒/皿~40粒/皿;20℃下黑暗培养10d。 取可疑症状的根、茎、叶的病健交界处,剪成5mm×5mm小块,1%的次氯酸钠溶液消毒5min,无 菌水冲洗3次,吸干水分,置APDA培养基上,20℃下黑暗培养10d。 4.4 形态学鉴定 在APD培养基上,从第3天开始观察分离样品周围是否有菌丝产生,挑出菌丝转接到PDA培养基 上,20℃下黑暗纯化培养,5d~7d后开始观察记录病菌的培养性状,显微镜下观察记录分生孢子和分 生孢子器的形态和大小。 4.5 分子生物学鉴定 4.5.1 DNA提取 将制备的商用油菜籽初检样品用液氮研磨后,取样0.1g~0.2g,采用CTAB方法提取DNA(参见 附录B)。 将分离到的真菌菌丝收集,放入1.5mL浸在液氮里的离心管中,用塑料杵碾碎,采用CTAB方法 提取DNA(参见附录B)。 4.5.2 PCR检测 常规PCR方法一:特异性引物Lm3(5'-GCCCACCAATTGGATCCCCTA-3')和Lm4(5'-AG GCGAGTCCCAAGTGGAACA-3')。PCR反应总体积为30μL,包含10mmol/LTris-HCl,50mmol/L KCl(pH8.3),2.5mmol/LMgCl2,dATP、dGTP、dCTP、dTTP浓度均为100μmol/L,引物浓度各为 100nmol/L,2μL模板DNA,1.5UTaqDNA聚合酶。反应循环程序为:94℃3min;94℃30s,67℃ 30s,72℃30s,35个循环;最后72℃5min。取10μL扩增产物与3μL的6×上样缓冲液混匀,在 1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中,4V/cm~6V/cm电泳30min,溴化乙锭(EB)染色后在成像系统 中成像分析。 常规PCR方法二:特异性引物LmacF(5'-CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA-3')和LmacR (5'-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3')。PCR反应总体积为30μL,包含10mmol/LTris-HCl, 50mmol/LKCl(pH8.3),2.5mmol/LMgCl2,dATP、dGTP、dCTP、dTTP浓度均为100μmol/L,引物 浓度各为100nmol/L,2μL模板DNA,1.5UTaqDNA聚合酶。反应循环程序为:94℃3min;94℃ 30s,63℃30s,72℃40s,35个循环;最后72℃5min。取10μL扩增产物与3μL的6×上样缓冲液 混匀,在1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中,4V/cm~6V/cm电泳30min,溴化乙锭(EB)染色后在 成像系统中成像分析。 套式PCR:第一轮扩增引物Lm2(5'-TCAGTGGCGGCAGTCTACTT-3')和Lm6(5'-GCCGGCT GCCAATTGTTTCA-3'),第二轮扩增引物Lm3(5'-GCCCACCAATTGGATCCCCTA-3')和Lm4(5'- 2GB/T31793—2015 AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA-3')。PCR反应总体积为30μL,包含10mmol/LTris-HCl, 50mmol/LKCl(pH8.3),1.5mmol/LMgCl2,dATP、dGTP、dCTP、dTTP浓度均为100μmol/L,引物 浓度各为100nmol/L,模板DNA为2μL,1.5UTaqDNA聚合酶。反应循环程序为94℃3min; 94℃30s,67℃(引物Lm2/6为60℃)30s,72℃30s,35个循环(引物Lm2/Lm6第一轮扩增25个 循环);最后72℃5min。第一轮扩增产物1μL用作第二轮扩增的模板。取10μL扩增产物与3μL的 6×上样缓冲液混匀,在1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中,4V/cm~6V/cm电泳30min,溴化乙锭 (EB)染色后在成像系统中成像分析。 实时荧光PCR:引物Lm3(5'-GCCCACCAATTGGATCCCCTA-3')/R2(5'-GGCGCAAAAT GTGCTGCGCT-3'),探针Probe-M(5'-FAM-CACTTGGGACTCGC-MGB-3')。PCR反应体系为 25μL,包括12.5μL2×PremixExTaq、上下游引物(5μmol/L)和探针(5μmol/L)各1μL、2μL模板 DNA、0.5μL50×ROXReferenceDyeⅡ,加无菌水补至25μL。反应程序为:95℃10s;95℃15s, 60℃1min,40个循环。 5 鉴定特征 5.1 病菌形态 初生菌丝无色,有分隔;菌丝呈白色放射状,初期可见结节状菌丝结,后期菌丝结形成黑色至褐色分 生孢子器;分生孢子器球形至扁球形,褐色至深黑褐色,散生、埋生或半埋生于菌丝中,直径100μm~ 400μm,顶部具孔口,周围有浅粉色、红色或紫色的黏性分生孢子团溢出,内含大量的分生孢子;分生孢 子无色透明,椭圆形至纺锤形,内含2个油球,孢子大小(3.3μm~6.1μm)×(1.4μm~2.4μm)。 假囊壳在感病的木质化部位上产生,黑色,球形,埋生或爆裂,具孔口,直径360μm~500μm;子囊 棍棒形到圆柱形,双层壁,大小(70μm~120μm)×(10μm~17μm),内含8个双列的子囊孢子;子囊 孢子长椭圆形,黄褐色,具5个隔膜,大小(30μm~70μm)×(4μm~9μm)。人工培养条件下未见有 性型的形成。 病菌形态图参见附录C中图C.1,与其近似种的形态比较参见附录D中表D.1。 5.2 PCR检测 如常规PCR引物Lm3/Lm4扩增产物为279bp,或引物LmacF/LmacR扩增产物为331bp,视为 油菜茎基溃疡病菌阳性。 如套式PCR引物Lm2/Lm6和Lm3/Lm4扩增产物为279bp,视为油菜茎基溃疡病菌阳性。 实时荧光PCR检测,在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下: ———Ct值小于或等于36,判定油菜茎基溃疡病菌阳性; ———Ct值大于或等于40,判定油菜茎基溃疡病菌阴性; ———Ct值在36~40之间,应重做实时荧光PCR,再次扩增后如Ct值小于或等于36,