书 书 书犐犆犛 ６５ ． ０２０ ． ３０ 犅 ４４ 中华人民共和国国家标准 犌犅 ／ 犜 １４９２７ ． ２ — ２００８ 代替 ＧＢ ／ Ｔ１４９２７．２ — ２００１ 实验动物 近交系小鼠 、 大鼠免疫标记检测法 犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔犪狀犻犿犪犾 — 犐犿犿狌狀狅犾狅犵犻犮犪犾犿犪狉犽犲狉狅犳犻狀犫狉犲犱犿犻犮犲犪狀犱狉犪狋狊 ２００８  １２  １０ 发布 ２００９  ０３  ０１ 实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布书 书 书前 　　 言 　　 ＧＢ ／ Ｔ１４９２７ 共分 ２ 个部分 ： ——— 第 １ 部分为 《 实验动物 　 近交系小鼠 、 大鼠生化标记检测法 》； ——— 第 ２ 部分为 《 实验动物 　 近交系小鼠 、 大鼠免疫标记检测法 》。 本部分为 ＧＢ ／ Ｔ１４９２７ 的第 ２ 部分 。 本部分自实施之日起 ， 代替 ＧＢ ／ Ｔ１４９２７．２ — ２００１ 《 实验动物 　 近交系小鼠 、 大鼠皮肤移植检测 法 》。 本部分与 ＧＢ ／ Ｔ１４９２７．２ — ２００１ 相比主要技术差异如下 ： ａ ） 　 修订实验动物近交系小鼠 、 大鼠皮肤移植法部分内容 ； ｂ ） 　 增加小鼠 Ｈ２ 单倍型微量细胞毒检测法 ； ｃ ） 　 本部分名称修改为 “ 实验动物 　 近交系小鼠 、 大鼠免疫标记检测法 ”。 本部分附录 Ａ 为资料性附录 。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口 。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草 。 本部分主要起草人 ： 邢瑞昌 、 刘双环 、 马丽颖 、 岳秉飞 、 鲍世民 。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 ： ——— ＧＢ ／ Ｔ１４９２７．２ — １９９４ ， ＧＢ ／ Ｔ１４９２７．２ — ２００１ 。 Ⅰ 犌犅 ／ 犜 １４９２７ ． ２ — ２００８ 实验动物 近交系小鼠 、 大鼠免疫标记检测法 １ 　 范围 ＧＢ ／ Ｔ１４９２７ 的本部分规定了近交系小鼠 、 大鼠皮肤移植术法和近交系小鼠 Ｈ２ 单倍型 （ Ｈａｐｌｏ ｔｙｐｅ ） 检测方法 。 本部分近交系小鼠 、 大鼠皮肤移植术法适用于近交系小鼠和大鼠在培育过程中遗传纯度的检查以 及近交系小鼠和大鼠在繁殖饲养过程中的遗传监测 。 近交系小鼠 Ｈ２ 单倍型 （ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ） 检测方法适 用于近交系小鼠培育和繁殖饲养过程中的遗传监测 ， 主要检测 Ｈ２ 复合体 Ｄ 区和 Ｋ 区的抗原分型 。 ２ 　 近交系小鼠和大鼠皮肤移植术法 ２ ． １ 　 技术原理 移植物在同一近交系中可以被互相接受 ， 即同系移植 （ ｉｓｏｇｒａｆｔ ） 是成功的 。 移植物在不同近交系中互相排斥 ， 亦即同种移植 （ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ） 是不成功的 。 Ｆ１ 代动物可以接受任何一个双亲的组织移植物 ， 双亲则不能接受 Ｆ１ 代的移植物 。 Ｆ１ 代动物可以接受 Ｆ２ 代以后各代动物的移植物 。 亲本品系可以接受某些 Ｆ２ 代以后各代动物的移植物 ， 但是绝大部分被排斥 。 本部分采用背部皮肤移植法和尾部皮肤移植法 。 两种方法原理相同 ， 并具有同等标准效力 。 ２ ． ２ 　 背部皮肤移植法 ２ ． ２ ． １ 　 设备和材料 ２ ． ２ ． １ ． １ 　 固定板 （ １８ｃｍ×１２ｃｍ ）。 ２ ． ２ ． １ ． ２ 　 戊巴比妥钠 （ 医用 ）。 ２ ． ２ ． １ ． ３ 　 医用橡皮膏 。 ２ ． ２ ． １ ． ４ 　 医用凡士林 。 ２ ． ２ ． １ ． ５ 　 粉剂青霉素 Ｇ 钠 （ ８０ 万 Ｕ ， 人或兽用 ）。 ２ ． ２ ． １ ． ６ 　 ３％ 碘酒棉球 。 ２ ． ２ ． １ ． ７ 　 ７５％ 酒精棉球 。 ２ ． ２ ． １ ． ８ 　 眼科剪刀 。 ２ ． ２ ． １ ． ９ 　 眼科镊子 。 ２ ． ２ ． １ ． １０ 　 一次性注射器 （ １ｍＬ ）。 ２ ． ２ ． １ ． １１ 　 纱布 （ 剪成 ４０ｍｍ 长 ， ２５ｍｍ 宽若干条 ； 厚 ２ 层 ～ ３ 层若干块 ， 其上涂医用凡士林及粉剂青 霉素 Ｇ 钠 ）。 ２ ． ２ ． １ ． １２ 　 脱脂棉做成的棉球 。 ２ ． ２ ． １ ． １３ 　 将手术器材置于高压锅内 １２１℃ 、 ４０ｍｉｎ 高压灭菌 。 ２ ． ２ ． ２ 　 操作步骤 ２ ． ２ ． ２ ． １ 　 随机取同性别 ４ 周龄 ～ ８ 周龄的动物 １０ 只 ， 动物可来自基础群或血缘扩大群 。 ２ ． ２ ． ２ ． ２ 　 每只动物分别编号并称取体重 ， 详细记录品系名称 、 性别 、 出生年月日 、 谱系及其他特征 。 ２ ． ２ ． ２ ． ３ 　 用无菌生理盐水配制 ０．７％ 戊巴比妥钠溶液 。 ２ ． ２ ． ２ ． ４ 　 采用腹腔注射 ０．７％ 戊巴比妥钠溶液麻醉动物 。 小鼠每 １０ｇ 体重注射 ０．１ｍＬ ， 大鼠每 ２０ｇ １ 犌犅 ／ 犜 １４９２７ ． ２ — ２００８ 体重注射 ０．１ｍＬ 。 因不同品系动物对麻醉剂敏感性不同 ， 注射量可适当增减 （ 手术时室温应控制在 ２５℃ ～ ２８℃ 之间 ）。 ２ ． ２ ． ２ ． ５ 　 待动物麻醉失去知觉后 ， 将其背部朝上放在固定板上 ， 固定动物 ， 剪去被毛 ， 并用 ３％ 碘酒棉 球和 ７５％ 酒精棉球消毒 。 ２ ． ２ ． ２ ． ６ 　 在背部剪下直径 ５ｍｍ ～ １０ｍｍ 的皮肤左右各一块 （ 其中一块用做自体移植 ， 另一块用做异 体移植 ）。 ２ ． ２ ． ２ ． ７ 　 将剪好的皮片翻转过来放入带少量生理盐水的双碟 （ 直径为 ６ｃｍ ） 中 ， 用眼科剪刀 ， 轻轻地切 去皮下组织至真皮 ， 然后放在无菌生理盐水中冲洗一下 。 ２ ． ２ ． ２ ． ８ 　 两只动物的皮片 ， 除左侧皮片做自体移植外 ， 右侧皮片循环交换 ， 逆毛方向移植并使之吻合 。 ２ ． ２ ． ２ ． ９ 　 覆盖涂过凡士林和青霉素 Ｇ 钠的纱布块 ， ３ 层 ～ ４ 层 ， 用 １ｃｍ 宽橡皮膏固定 ， 松紧适度 。 ２ ． ２ ． ２ ． １０ 　 手术结束待动物苏醒后 ， 把动物放入鼠盒内 ， 并挂上标记卡片 ， １０ｄ 后拆除包扎 。 ２ ． ２ ． ３ 　 结果观察 ２ ． ２ ． ３ ． １ 　 拆包后 ， 发现皮片干瘪 、 脱落则为技术失败 。 如皮片脱痂 ， 手术部位平整 、 一周后有新毛长出 则为手术成功 。 对照自体移植 ， 技术失败率不得大于 １０％ 。 ２ ． ２ ． ３ ． ２ 　 如果皮片在 ２ 周 ～ ３ 周内脱落 ， 则为急性排斥 。 遗传污染通常引起急性排斥 。 ２ ． ２ ． ３ ． ３ 　 如果皮片在 ３ 周脱落 ， 则为慢性排斥 。 移植物有否慢性排斥至少观察 １００ｄ ， 遗传突变通常引 起慢性排斥 。 ２ ． ２ ． ３ ． ４ 　 如果对结果怀疑 ， 则要进行重新移植 ， 可以使用一批新的动物 ， 也可以使用已做过移植但对结 果产生怀疑的动物 。 如果是后者 ， 则排斥更迅速 、 更典型 。 ２ ． ３ 　 尾部皮肤移植法 ２ ． ３ ． １ 　 设备和材料 ２ ． ３ ． １ ． １ 　 １１ 号手术刀柄 。 ２ ． ３ ． １ ． ２ 　 １１ 号手术尖刀片 。 ２ ． ３ ． １ ． ３ 　 玻璃套管 （ 直径 ８ｍｍ ， 大鼠可适当大些 ）。 ２ ． ３ ． １ ． ４ 　 其他材料见 ２．２．１ 。 ２ ． ３ ． ２ 　 操作步骤 ２ ． ３ ． ２ ． １ 　 随机取同性别 ４ 周龄 ～ ８ 周龄的动物 １０ 只 ， 动物可来自于基础群 、 血缘扩大群或生产群 。 ２ ． ３ ． ２ ． ２ 　 每只动物分别编号并称取体重 ， 详细记录品系名称 、 性别 、 出生年月日 、 谱系及其他特征 。 ２ ． ３ ． ２ ． ３ 　 用无菌生理盐水配制 ０．７％ 戊巴比妥钠溶液 。 ２ ． ３ ． ２ ． ４ 　 采用腹腔注射麻醉 ０．７％ 戊巴比妥钠溶液动物 ， 小鼠每 １０ｇ 体重注射 ０．１ｍＬ ， 大鼠每 ２０ｇ 体重注射 ０．１ｍＬ 。 因不同品系动物对麻醉剂敏感性不同 ， 注射量可适当增减 （ 手术时室温应控制在 ２５℃ ～ ２８℃ 之间 ）。 ２ ． ３ ． ２ ． ５ 　 待动物麻醉失去知觉后 ， 将 ５ 只一组按顺序采取仰卧式放在一块滤纸上 ， 并用 ３％ 碘酒棉球 和 ７５％ 酒精棉球消毒鼠尾 。 ２ ． ３ ． ２ ． ６ 　 用左手食指按住动物尾根 ， 左手拇指按住尾尖 ， 固定鼠尾并使其微微伸展 ， 然后右手持解剖 刀 ， 刃面朝上 ， 与尾部皮肤成 ２０° ～ ３０° 夹角 ， 在尾静脉上部或两条尾静脉之间 ， 在离尾部 ５ｍｍ 处削下一 片宽约 ２ｍｍ ～ ３ｍｍ ， 长约 ７ｍｍ ～ ８ｍｍ 的皮肤 ， 其厚度前者以没有严重出血 ， 后者能足以暴露出白色 的肌腱但又不割伤血管为宜 。 ２ ． ３ ． ２ ． ７ 　 右手将刀片逆时针方向交给左手 ， 附着在刀片上的皮片相应转 １８０° ， 将皮片用眼科镊子取下 贴在原创面上 ， 并尽量使其吻合 ， 用一小片滤纸覆盖 ， 再轻轻按压一下 ， 然后取掉滤纸片 ， 该移植作为自 体移植对照 。 ２ ． ３ ． ２ ． ８ 　 按照 ２．３．２．６ 和 ２．３．２．７ 步骤 ， 完成另 ４ 只动物的自体移植对照 。 ２ ． ３ ． ２ ． ９ 　 按照 ２．３．２．６ 和 ２．