ICS 11.220 B 41 备案号： 湖 北 省 地 DB42 方 标 准 DB42/T 1024—2014 牛支原体肺炎诊断技术规程 Diagnostic procedures for Mycoplasma bovis pneumonia 2014–09–02 发布 湖北省质量技术监督局 2014–11–01 实施 发 布 DB42/T 1024—2014 目 录 前 言 ............................................................................... II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语与定义 ......................................................................... 1 4 牛支原体肺炎诊断 ................................................................... 1 4.1 流行病学 ....................................................................... 2 4.2 临床症状 ....................................................................... 2 4.3 病理变化 ....................................................................... 2 4.4 分离培养和鉴定 ................................................................. 2 4.5 生化反应鉴别检测 ............................................................... 3 4.6 PCR 鉴别检测.................................................................... 3 5 结果判断 ........................................................................... 5 附录 A（规范性附录） 试剂的配制........................................................ 6 附录 B（资料性附录） 牛支原体肺炎判断流程图 ............................................. 8 附录 C（规范性附录） 生化反应鉴别检测.................................................. 9 I DB42/T 1024—2014 前 言 本标准按GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由华中农业大学提出。 本标准由华中农业大学归口。 本标准起草单位：华中农业大学、随州市弘大畜牧有限责任公司、松滋市春珍肉牛养殖场。 本标准主要起草人：郭爱珍、白智迪、晁金、胡长敏、陈颖钰、陈焕春、彭清洁、曹永强、周春。 II DB42/T 1024—2014 牛支原体肺炎诊断技术规程 1 范围 本规程规定了牛支原体肺炎诊断技术以及结果判定依据。 本规程适用于牛支原体肺炎的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18649—2002 牛传染性胸膜肺炎（牛肺疫）诊断技术 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本规程。 3.1 牛支原体 Mycoplasma bovis M.boivs 属于柔膜纲（Mollicutes）支原体科（Mycoplasmataceae）支原体属（Mycoplasma）成员。与羊无 乳支原体（Mycoplasma agalactiae）关系密切，曾被命名为无乳支原体牛亚种（Mycoplasma agalactiae subsp. Bovis）。主要导致化脓性或凝固性坏死性肺炎，还可发见关节炎、腱鞘炎、角膜结膜炎、中耳 炎、乳腺炎等。 3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction PCR 是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。一般由三个步骤组成：模板的热变性，寡核苷酸引物复 性到单链靶序列上以及由热稳定DNA聚合酶催化的复性引物引导的新生DNA链延伸聚合反应。 3.3 胸膜肺炎样微生物 pleuropnenmonia-like organism PPLO 即支原体（ Mycoplasma ），因为最初认识的支原体病为牛传染性胸膜肺炎（contagious pleuropneumonia），所以将该病的病原命名为胸膜肺炎微生物（pleuropneumonia organism，PPO)。 之后，在人和动物的呼吸道、消化道和泌尿生殖道分离出多种特征相同的微生物，统称为胸膜肺炎样微 生物 (Pleuropneumonia like organism)，简称PPLO。 4 牛支原体肺炎诊断 1 DB42/T 1024—2014 牛支原体肺炎诊断技术分为流行病学分析，临床症状观察，病理变化检查，支原体纯化和反应鉴别 检测，PCR鉴别检测等，确诊有赖于2种或2种以上方法的联用与综合判断。 4.1 流行病学 育肥牛多发，与应激（长途运输、热或冷应激、抵抗力下降等）相关。牛运达后1周～2周发病，运 输途中经历恶劣气侯可加快发病。病程1个月以上。年龄越小病情越严重。 初生犊牛也可发病，1周～2周龄左右出现明显的呼吸道症状和关节炎症状，与吸吮含牛支原体的母 乳有关。 4.2 临床症状 发病率60%以上，死亡率可高达10%～50%。初期发热，体温升至42℃左右；有清亮或脓性鼻汁，咳 嗽，气喘，半夜及清晨咳嗽加剧；精神沉郁，食欲减退；眼结膜潮红，流浆液性或脓性分泌物。 病程较长时，患牛明显消瘦，可见关节炎，表现为关节脓肿，跛行甚至卧地不起；也可见腹泻，粪 便呈水样，可能带有血液和黏膜；可见中耳炎。严重者可发生死亡。 常规抗生素治疗效果差，病情反复发作。 4.3 病理变化 主要集中在肺部与胸腔。肺和胸膜可能粘连，胸腔积液；心包积液；肺部病变轻者可见肺尖叶、心 叶及部分膈叶边缘局部可见红色肉变，重者可见大面积肉变区内广泛分布有黄白色干酪样坏死灶或化脓 灶。其它病变与继发症或并发症有关。发生关节炎时，可见关节腔积液，有大量干酪样坏死物。 4.4 分离培养和鉴定 4.4.1 病料采集 无菌条件下取样，首选肺组织，其次为鼻腔深部分泌物和气管分泌物。 在肺组织病变与正常组织交界处，取3cm ～5cm 大小的组织样本，冷藏条件下快速送检或置无菌 40%～50%甘油生理盐水中，冷藏条件下快速送检按照GB/T 18649—2002进行。 气管分泌物可直接收集，冷藏条件下快速送检。 鼻拭子采集后置装有0.5 mL～1.0mL灭菌生理盐水的无菌Eppendorf管中，盖严，冷藏条件下快速送 检。 所有样本均须妥善包装，防渗漏，防破碎。标签用记号笔填写，应信息完整，字迹清晰，并附采样 单。 3 3 4.4.2 分离培养 4.4.2.1 材料准备 本方法的试验用水应符合GB/T 6682—2008规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。 培养基：支原体液体培养基见附录A中A.1,固体培养基配制见附录A中A.2。 4.4.2.2 操作方法 肺组织的初代接种培养方法按照GB/T 18649—2002进行，在表层消毒后，在病变和正常组织交界处 取米粒至绿豆大小深层肺组织，先在支原体固体培养基表面进行样本切面涂抹，再在涂抹处划线，将病 料接种于培养基表面，置于37℃、5% CO 恒温培养箱中培养，2d～3d后，在光学显微镜下4×10倍放大， 可观察支原体典型的“煎蛋样”菌落形态。 2 2 DB42/T 1024—2014 鼻拭子样本于采集管中涡旋5 min，取400μL悬液经450nm孔径滤膜过滤，取100μL滤液均匀涂布于 支原体固体培养基表面，置于37℃、5% CO 培养箱培养, 2d～3d后,用光学显微镜4×10倍观察菌落形态。 纯化或转接时，从支原体固体培养基挖取带支原体菌落的小块琼脂，涂抹、再划线接种于固体培养 基表面，或接种于支原体液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中，2d～3d后,观察培养基上生长的典型 菌落或观察到液体培养基由红色透明变为橙黄色透明时，表明有支原体生长。 2 4.5 生化反应鉴别检测 4.5.1 材料准备 生化管：葡萄糖、甘露醇、精氨酸、尿素、磷酸酶等生化管为商品化试剂。 牛支原体HB0801株作为牛支原体阳性对照，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No: M2010040。 4.5.2 操作方法 吸取10μL（约10 CFU）的牛支原体液体纯培养物，分别深部接种于各种生化管中，置于37℃恒温 培养箱中，12h～24h后观察结果。牛支原体不分解葡萄糖、甘露醇、精氨酸和尿素，但具有磷酸酶活性， 其牛支原体生化反应鉴别见附录C。 7 4.6 PCR 鉴别检测 4.6.1 16S rRNA PCR 检测 利用16SrRNA通用引物，进行PCR扩增，将PCR产物测序，获得序列与GenBank中的序列进行同源性比 对，鉴定牛支原体。但该方法不能区分牛支原体与无乳支原体。 4.6.1.1 仪器和耗材 PCR仪，电炉，离心机，混匀器，微量可调移液器，1.5 mL Eppendorf管，PCR反应管，核酸电泳仪， 凝胶成像系统。 4.6.1.2 试剂 灭菌双蒸水，Taq Mix，琼脂糖。 4.6.1.3 样本处理 在肺组织病健交界处取一小块深层组织置于玻璃匀浆器中，加入3mL～4mL灭菌PBS，反复挤压组织 块，制成组织悬液。将组织悬液自然沉淀10min，取上部液体通过0