ICS 67.200.10 X 14 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 1997—2013 食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合 物（TGP）的测定 高效空间排阻色谱法 Determination of oxidized triacylglycerol(OX-TG) and oxidized triacyldycerol polymer(TGP) in edible oils by a high-performance size-exclusion chromatography 2013 - 12 - 05 发布 安徽省质量技术监督局 2014 - 01 - 05 实施 发 布 DB34/T 1997—2013 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省质量技术监督局、安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会提出。 本标准由安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽国家农业标准化与监测中心、国家农副加工食品质量监督检验中心、上海市 粮食科学研究所。 本标准主要起草人：徐彦辉、何俊、房志杰、曹文明、顾亮、聂磊、薛斌、姚彦如。 I DB34/T 1997—2013 食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定 高效空间排阻色谱法 1 范围 本标准规定了食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定 高效空间排阻色谱法。 本标准适用于食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定。 本标准的方法检出限为 0.2％。 本标准适用于风险监控及科学研究。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-2008，neq ISO3696：1997） GB/T 6379.1 测 量 方 法 与 结 果 的 准 确 度 ( 正 确 度 与 精 密 度 ) 第 1 部 分 : 总 则 与 定 义 (GB/T 6379.1-2004，ISO5725-1：1994，IDT) GB/T 6379.2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度) 第2部分:确定标准测量方法重复性与 再现性的基本方法(GB/T 6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT) 3 原理 通过自动制备型快速柱层析技术的分离，油脂试样被分为非极性组分和极性组分两部分，其中极性 组分用高效空间排阻色谱进行分析，采用面积归一化法进行定量。 4 试剂 4.1 除非另有说明，仅使用分析纯试剂，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.2 乙醚，使用前使其回温至 10℃～18℃之间。 4.3 石油醚，30℃～60℃沸程，使用前使其回温至 10℃～18℃之间。 4.4 三氯甲烷。 4.5 冰醋酸。 4.6 95％乙醇。 4.7 磷钼酸。 4.8 无水硫酸钠。 4.9 硅胶吸附剂：硅胶 60，平均粒径为 0.063 mm～0.200 mm（相当于 ASTM 规范的 70 目～230 目的 2 粒径分布）的无定形硅胶，孔径 60Å，水分含量 7±0.5％，孔体积 0.8 mL/g，表面积 500 m /g，pH 值 7.0,拆封后于玻璃干燥器（5.5）内保存。 1 DB34/T 1997—2013 4.10 非极性洗脱剂：石油醚（30℃～60℃沸程）+乙醚 =87+13，870 mL 的石油醚（30℃～60℃沸程） （4.2）中加入 130 mL 的乙醚（4.1），充分混匀，现用现配。 4.11 极性组分洗脱液：丙酮+乙醚=40+60，600 mL 的乙醚（4.1）中加入 400 mL 的丙酮（4.15），充 分混匀，现用现配。 4.12 薄层色谱展开剂：石油醚（30℃～60℃沸程）+乙醚+冰醋酸=70+30+2，70 mL 的石油醚（30℃～ 60℃沸程）（4.2）中加入 30 mL 的乙醚（4.1）和 2 mL 的冰醋酸（4.4），充分混匀，现用现配。 4.13 薄层色谱显色剂：100 克的磷钼酸（4.6）固体先完全溶解于适量的 95％乙醇（4.5）中，然后 再用 95％乙醇稀释至 1 L，最后分装入喷雾瓶中。 4.14 薄层色谱层析板：长 200 mm、宽 100 mm 的玻璃板，上涂一层 0.25 mm 厚的硅胶 60（平均粒径 为 10～12 µm，其它性质参数同“4.8” ）或其它等效硅胶，且不含任何的荧光指示剂。 4.15 薄层色谱点样毛细管：长 100 mm，内径 0.3 mm。 4.16 丙酮, 使用前使其回温度至 10℃～18℃之间。。 4.17 食用油极性组分 FLASH 色谱柱（EOPC FLASH）：内填装 20 g 粒径为 40 μm～60 μm 的硅胶，柱 外壳为聚丙烯制成，铝箔密封包装。 4.18 10 mL 一次性使用无菌注射器。 5 仪器与设备 5.1 旋转蒸发仪。 5.2 分析天平：感量为 0.1 mg。 5.3 真空恒温干燥箱。 5.4 恒温干燥箱。 5.5 玻璃干燥器（内装有变色硅胶干燥剂）。 5.6 薄层色谱玻璃层析缸，能与薄层色谱板（4.13）配套。 5.7 食用油极性组分快速制备型柱层析系统（EOPC PFC SYSTEM）： 配置二元泵、紫外检测器、自动 收集系统、实时监测系统和溶剂温度控制系统。 5.8 标准磨口 500 mL 圆底烧瓶。 5.9 10 mL 玻璃烧杯。 5.10 1000 mL 小口玻璃收集瓶。 6 分析步骤 6.1 试样的制备 6.1.1 除杂质 作为试样的样品应为液态、澄清、无沉淀并充分混匀。如果样品不澄清、有沉淀，则须将油脂置于 50℃的水浴或恒温干燥箱（5.4）内，将油脂的温度加热至 50℃并充分振摇以熔化可能的油脂结晶。若 此时油脂样品变为澄清、无沉淀，则可作为试样，否则应将油脂置于 50℃的恒温干燥箱（5.4）内，用 滤纸过滤不溶性的杂质，取过滤后的澄清液体油脂作为试样，为防止油脂氧化，过滤过程应尽快完成。 对于凝固点高于 50℃或含有凝固点高于 50℃油脂成分的样品，则须将油脂置于比其凝固点高 10 ℃左右的水浴或恒温干燥箱（5.4）内，将油脂加热并充分振摇以熔化可能的油脂结晶。若还需过滤， 则将油脂置于比其凝固点高 10℃左右的恒温干燥箱（5.4）内，用滤纸过滤不溶性的杂质，取过滤后的 澄清液体油脂作为试样，为防止油脂氧化，过滤过程应尽快完成。 2 DB34/T 1997—2013 6.1.2 干燥脱水 若油脂中含有水分，则通过“5.1.1”的处理后仍旧无法达到澄清，须进行干燥脱水。对于室温下为 液态、无明显结晶或凝固现象的油脂，以及经过“5.1.1”的处理并冷却至室温后为液态、无明显结晶或 凝固现象的油脂，可按每 10 g 油脂加入 1～2 g 无水硫酸钠（4.7）的比例加入无水硫酸钠，并充分 搅拌混合吸附脱水，然后用滤纸过滤，取过滤后的澄清液体油脂作为试样。 对于室温下有结晶或凝固现象的油脂，以及经过“5.1.1”的处理并冷却至室温后有明显结晶或凝固 现象的油脂，可将油脂样品用适量的石油醚（4.2）完全溶解后再用无水硫酸钠吸附脱水，然后滤纸过 滤收集滤液，将滤液置于水浴温度为 45℃的旋转蒸发仪（5.1）内，负压条件下，将其中的溶剂旋转蒸 干，取残留的澄清液体油脂作为试样。 6.2 FLASH 色谱柱的活化 以非极性组分洗脱液（4.9）为流动相对 EOPC PFC SYSTEM 层析系统（5.7）的流动相管路进行润 洗，排尽流动相管路内的气体。取 1 支 EOPC FLASH 色谱柱（4.16），连接入 EOPC 快速制备型柱层析 系统的流动相管路，以非极性组分洗脱液 （4.9）为流动相，25 mL/min 的流速冲洗 FLASH 色谱柱 10 min， 使 FLASH 色谱柱完全被溶剂所浸润。 6.3 非极性组分的分离 取 1 只干净的 10 mL 玻璃烧杯（5.9），准确称取 1 g（精确到 0.001 g）的油脂样品（m），然 后用 5 mL 的石油醚（30℃～60℃沸程） （4.2）将油脂样品充分溶解，成为上样液。将 FLASH 色谱柱 的上端与流动相管路断开，用 1 支干净的 10 mL 一次性塑料注射器（4.17）吸取全部的上样液后，快 速注射入 FLASH 色谱柱的上端入口处，再用 3 mL 的石油醚（30℃～60℃沸程）洗涤 10 mL 玻璃烧杯 内残留的上样液，洗涤液也用同一支 10 mL一次性塑料注射器全部吸取后，注射入 FLASH 色谱柱的上 端入口处，再将 FLASH 色谱柱的上端与流动相管路连接，按以下参数进行非极性组分的分离： a) 流动相：非极性组分洗脱液（4.9）； b) 流动相流速：25 mL/min； c) 部分收集器：以 1000 mL 小口玻璃收集瓶（5.10）为收集容器，从洗脱开始以全收集模式进 行收集； d) 紫外检测器监测波长：200 nm； e) 启用实时监测系统，获得洗脱色谱图； f) 溶剂温度控制系统温度：10℃； g) 洗脱时间：11 min。 注：进行分离操作时，实验的环境温度应控制在 10℃～25℃间。 6.4 极性组分的洗脱 取 1 个干净的 500 mL 圆底烧瓶（5.8）放入（103±2）℃的恒温干燥箱（5.4）内，烘 1 h 左右， 然后取出立即放入玻璃干燥器（5.5）内冷却至室温，然后称重（M1）。在完成“6.3”的操作后，立即对 吸附有极性组分的 FLASH 色谱柱进行进一步的洗脱处理，具体参数如下： a) 流动相：极性组分洗脱液（4.10）； b) 流动相流速：25mL/min； c) 部分收集器：以另一个干净的 1000 mL 小口玻璃收集瓶（5.10）为收集容器，从洗脱开始以 全收集模式进行收集； d) 紫外检测器监测波长：200 nm； 3 DB34/T 1997—2013 启用实时监测系统，获得洗脱色谱图； f) 溶剂温度控制系统温度：10℃； g) 洗脱时间：20 min。 将 1000 mL 小口玻璃收集瓶内所有收集的洗脱液倒入 500 mL 圆底烧瓶中，然后将此装有收集洗 脱液的 500 mL 圆底烧瓶置于水浴温度为 60℃的旋转蒸发仪（5.1）内，先在非真空条件下，将其中的 溶剂旋转蒸发至一半，再在负压条件下，将其中的溶剂旋转蒸发至近干。然后将此 500 mL 圆底烧瓶放 入 40℃的真空恒温干燥箱（5.3），在 0.1 MPa 的负压条件下，烘 20 min～30 min 后放入玻