ICS 65.020 B 05 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2218—2014 黄瓜灰霉病诊断及防控技术规程 Technical rules of diagnosis and control for grey mold in cucumber 2014 - 12 - 11 发布 吉林省质量技术监督局 2014 - 12 - 30 实施 发 布 DB22/T 2218—2014 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由吉林省农业委员会提出并归口。 本标准起草单位：吉林农业大学。 本标准的主要起草人：王晓梅、白庆荣、崔喜艳、张浩、韩玉珠、王薇、赵欣欣、王雪。 I DB22/T 2218—2014 黄瓜灰霉病诊断及防控技术规程 1 范围 本标准规定了黄瓜灰霉病诊断方法、病原检测技术及防控技术。 本标准适用于黄瓜灰霉病病害诊断、检测和综合防治。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 PDA potato dextrose agar 用于分离真菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。 2.2 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。 2.3 交替用药 alternative application 轮换使用无交互抗性的两种以上药剂的使用方式。 2.4 混合用药 mixed application 选择两种或两种以上作用方式和机制不同、无交互抗性的药剂混合使用。 3 黄瓜灰霉病病害诊断与检测技术 3.1 病症诊断 3.1.1 叶、茎 叶片染病，病斑初为水渍状，后变为不规则形的淡褐色病斑，边缘明显，有时病斑长出少量灰褐色 霉层。高湿条件下，病斑迅速扩展，形成直径 15 mm～20 mm 的大型病斑。茎蔓染病后，茎部腐烂，瓜 蔓折断，引起烂秧。 3.1.2 花、果 1 DB22/T 2218—2014 一般从开败的雌花开始侵入，在花蒂产生水渍状病斑，逐渐长出灰褐色霉层，引起花器变软、萎缩 和腐烂，并逐步向幼瓜扩展；瓜条染病，病部先发黄，后期产生白霉并逐渐变为淡灰色，导致病瓜生长 停止，变软、腐烂和萎缩，最后腐烂脱落。 3.2 病原形态学诊断 3.2.1 病原菌种类确定 黄瓜灰霉病病原菌为：灰葡萄孢 Botrytis cinerea Pers.ex Fr. ，半知菌类真菌（病原图见附录 A）。 3.2.2 显微镜检查 3.2.2.1 a) b) c) d) 徒手制片 取洁净的载玻片，在载玻片中间滴一滴清水； 用尖细的解剖针等直接挑取病部或培养基上的霉状物，置清水中； 尽量使病原物分散； 加盖盖玻片，在加盖盖玻片时，要使盖玻片的一侧边缘与水滴边缘接触，然后慢慢向下放盖玻 片，若盖玻片下有气泡应重新放置盖玻片，待显微观察。 3.2.2.2 镜检 在普通光学显微镜 10×10 倍下进行形态观察，病菌的孢子梗数根丛生，褐色，顶端具1 次～2 次 分枝，分枝顶端密生小柄，其上生大量分生孢子。分生孢子圆形至椭圆形，单细胞，近无色，大小(5.5 μm～16 μm)×(5.0 μm～9.25 μm) (平均11.5 μm×7.69 μm)，孢子梗(811.8 μm～1772.1 μm)×(11.8 μm～ 19.8 μm)。 3.3 病原菌的分子检测 3.3.1 病原菌的单孢分离 采集具有典型灰霉病病斑的黄瓜病叶，用毛刷刷取叶片上的孢子于盛有无菌水的烧杯中，采用稀释 平板法，挑取单个孢子，至PDA培养基上培养，待产孢后镜检，确定为葡萄孢后进行扩繁培养。 3.3.2 病菌基因组 DNA 提取及体外扩增 3.3.2.1 基因组提取 采用CTAB法，提取病菌基因组DNA（具体方法见附录B.1）。 3.3.2.2 PCR 扩增 以基因组DNA为模板，对病原物进行分子鉴定对菌株进行ITS区域扩增，采用通用引物ITS4/ITS5 （ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’/ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）。PCR产物送交生物技 术公司进行测序，测序结果在GenBank中进行Blast比对分析(PCR反应参数见附录B.2)。 4 发生规律 2 DB22/T 2218—2014 以菌核在土壤中或以菌丝及分生孢子在病残体上越冬或越夏。翌春条件适宜，菌核萌发，产生菌丝 体、孢子梗、分生孢子，分生孢子成熟后随气流、雨水、露水等传播。光照不足、低温（18 ℃～23 ℃） 和高湿（相对湿度94％以上）条件下易流行。该病害在吉林省多在冬春季节低温寡照的温室内发生。 5 黄瓜灰霉病防控技术 5.1 防治原则 病害防治应采取“预防为主，综合防治”的总原则，加强栽培管理，结合施用化学药剂进行病害综 合治理。 5.2 防治方法 5.2.1 5.2.1.1 农业防治 清洁田园与土壤消毒 定植前彻底清理前茬作物的残株烂叶以及杂草等；设施生产中，高温闷棚，对土壤高温消毒3 d以 上，之后充分通风。 5.2.1.2 轮作 与非寄主作物轮作。 5.2.1.3 膜下灌溉 采用膜下滴灌或开沟灌溉。 5.2.1.4 监测病情 开花期和果实膨大期及时查看病害发生情况。在苗期、瓜膨大前摘除幼瓜顶部的残余花瓣，发现病 花、病瓜、病叶要立即摘除并带出大棚、温室外深埋。拉秧后彻底清除病残落叶及残体。 5.2.2 5.2.2.1 生态防治 调控温度 白天温度控制在25 ℃～28 ℃，夜间温度保持在15 ℃～18 ℃。 5.2.2.2 控制湿度 在温度允许条件下，白天注意通风降湿，相对湿度的控制在40%以下，夜间湿度在85%以下。 5.2.2.3 增强光照 选用透光率高和保温性能好的无滴膜，保持薄膜表面清洁，保持光照充足。 5.2.3 5.2.3.1 化学防治 设施消毒 2 2 2 用硫磺粉2 kg/667 m ～3 kg/667 m 、敌百虫0.5 kg/667 m ，拌上锯末分多处点燃，密闭24 h后通 风排味。 3 DB22/T 2218—2014 5.2.3.2 药剂防治 设施黄瓜发病初期，可采用烟雾法、喷雾法、粉尘法等进行病害防治。以交替用药及混合用药为宜。 5.2.3.2.1 烟雾法 2 每667 m 均匀分放5 处～6 处，傍晚暗火点燃，闭棚过夜，次日早晨通风，隔6 d～7 d再熏1次。 烟雾剂用量按下列要求进行： 2 2 a) 20% 速克灵烟剂，200 g/667m ～250 g/667m ； 2 2 b) 10% 速克灵烟雾剂，250 g/667m ～350 g/667m ； 2 c) 50% 农利灵烟剂，250 g/667m 。 5.2.3.2.2 粉尘法 2 于傍晚喷撒粉尘剂，每667 m 每次用药1 kg，隔7 d～10 d喷撒一次，交替施用2 次～3 次。粉尘 剂用量按下列要求进行： a) 10% 速灭克粉尘剂； b) 5% 百菌清粉尘剂； c) 10% 杀霉灵粉尘剂。 5.2.3.2.3 喷雾法 在病害发生初期，在保护地相对湿度较低时可以采用喷雾法进行病害防治，喷雾要求均匀周到，不 留死角。可选择使用的药剂种类及用量见表1。每7 d～10 d喷洒1次，连续喷2 次～3 次，注意药剂交 替和轮换使用。 表1 喷雾防治黄瓜灰霉病药剂种类及用量 农药通用名称 有效含量及剂型 用量或稀释倍数 施用时间 嘧霉胺 pyrimethanil 400 g/L 悬浮剂 60 mL/667m ～90 mL/667m 甲硫·乙霉威 thiophanate methyl+ ethofencarb 65% 可湿性粉剂 1000～1500 倍液 在病害发生前 嘧菌环胺 cyprodinil 50% 水分散粒剂 600～1000 倍液 发病初期 腐霉利 procymidone 50% 可湿性粉剂 1000～2000 倍液 发病初期 菌核净 dimetachlone 40% 可湿性粉剂 800～1500 倍液 发病初期 异菌脲 iprodione 50% 可湿性粉剂 750～1000 倍液 嘧霉胺·乙霉威 pyrimethanil+ethofencarb 26% 水分散粒剂 2 2 100 g/667m ～150 g/667m 注：异菌脲不能与腐霉利(速克灵)、乙烯菌核利(农利灵)等作用方式相同的杀菌剂混用或轮用。 4 2 发病初期 发病初期 2 发病初期 DB22/T 2218—2014 AA 附 录 A （资料性附录） 黄瓜灰霉病病原图 图A.1 图A.2 黄瓜灰霉病病原图（手绘图） 黄瓜灰霉病病原图（扫描电镜图） 5 DB22/T 2218—2014 BB 附 录 B （资料性附录） CTAB 法提取病菌基因组 DNA 及 PCR 反应参数 B.1 CTAB法提取基因组DNA具体操作步骤 B.1.1 将清洗干净的研砵，研杵及药匙灭菌备用，配置好的CTAB提取液置于65 ℃水浴中预热； B.1.2 先加入少量灭菌的石碤砂于适量菌丝体中迅速研磨后分装于离心管中，再加入事先预热的CTAB 700 μL，反复颠倒震荡，使其充分混溶，65 ℃水浴1 h，期间每隔15 min拿出颠倒摇匀一次，并开盖放 气，防止因为气体受热膨胀而使盖子崩开。 B.1.3 取出冷却后，加入等体积的苯酚氯仿，轻轻翻转，混匀后，常温离心10 min(12000 rpm)； B.1.4 移取上清液至新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，轻轻转动离心管，使DNA沉淀，待白色絮 状沉淀出现后，放置于-20 ℃冰箱30 min以上，常温离心10 min（8000 rpm）； B.1.5 弃上清液，吸取适量75％的酒精于离心管中，轻轻摇匀，离心5 min（8000 rpm），漂洗2次，晾 干后，加适量TE缓冲液，4 ℃溶解。 B.1.6 用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA。 B.2 B.2.1 PCR反应参数 反应体系 10×PCR Buffer为5 μL，25 mM MgCl2加1 μL，10 mM dNTP加5 μL，5u/μLTaqDNA酶加2 μL，模板DNA 加1.5 μL，无菌双蒸水补足至50 μL。 B.2.2 PCR反应参数 B.2.2.1 ℃温浴10 B.2.2.2 B.2.2.3 度大于50 B.2.2.4 94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，48.5 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min共35个循环，72 min，4 ℃保存； PCR产