(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221083783 5.7 (22)申请日 2022.07.17 (71)申请人 中国人民解 放军军事科学院军事医 学研究院 地址 100850 北京市海淀区太平路27号 (72)发明人 陈薇　张晓鹏　胡暄　邹金桃　 卢醒　 (74)专利代理 机构 北京市众天律师事务所 11478 专利代理师 李新军 (51)Int.Cl. A61K 48/00(2006.01) A61K 9/51(2006.01) A61K 47/42(2017.01) A61K 47/32(2006.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种可降解纳米颗粒及其介导的Cas9/ sgRNA递送系统 (57)摘要 本发明公开了一种由作为内核的蛋白质和 作为外壳的高分子形成的可降解纳米颗粒， 所述 高分子是在所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基被修 饰引入双键后， 与不带电单体和阳离子单体在自 由基引发剂 存在下原位聚合形成。 所述纳米颗粒 由于胞质中阴离子分子的结合竞争和聚合物壳 中阳离子基团的水解， 能够在细胞内化后触发 Cas9/sgRNA从自组装复合物中释放， 从而实现高 达40%的基因编辑效率。 本发明还提供了上述纳 米颗粒的制备方法， 装 载有药物分子的所述纳米 颗粒以及其在制备基因治 疗药物中的应用。 权利要求书1页 说明书9页 附图16页 CN 115212321 A 2022.10.21 CN 115212321 A 1.一种由作为内核的蛋白质和作为外壳的高分子形成的可降解纳米颗粒， 其特征在 于， 所述高分子是在所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基被修饰引入双键后， 与不带电单体和阳 离子单体在自由基引发剂存在下原位聚合形成。 2.根据权利要求1所述的纳米颗粒， 其特征在于， 所述阳离子单体为2 ‑(二甲氨基)甲基 丙烯酸乙酯， 所述不带电单体为丙烯 酰胺， 所述自由基引发剂为过硫酸铵和四甲基乙二胺， 所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基的修饰为丙烯酰 化修饰。 3.根据权利要求2所述的纳米颗粒， 其特征在于， 使用N ‑羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯进行 所述的蛋白质中赖氨酸的伯胺基的修饰。 4.根据权利要求3所述的纳米颗粒， 其特征在于， 所述蛋白质为具有两个以上赖氨酸残 基的任意多肽。 5.根据权利要求 4所述的纳米颗粒， 其特 征在于， 所述蛋白质为牛 血清白蛋白。 6.根据权利要求5所述的纳米颗粒， 其特征在于， 所述纳米颗粒的红外光谱图具有以下 波段的特征吸收峰： 3317cm‑1、 2950cm‑1、 2820cm‑1、 2780cm‑1、 1730cm‑1、 1680cm‑1、 1540cm‑1、 1460cm‑1、 1395cm‑1和1148cm‑1。 7.根据权利要求5所述的纳米颗粒， 其特征在于， 所述牛血清白蛋白： 丙烯酰胺： 2 ‑(二 甲氨基)甲基丙烯酸乙酯： 过硫酸铵： 四甲基乙二胺的摩尔比为1： 3 000： 3000： 250： 1000。 8.权利要求1 –7任一所述纳米颗粒的制备 方法， 所述方法包括以下步骤： （1） 对作为颗粒内核的蛋白质进行改性， 使所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基被修饰引入 双键； （2） 由不带电单体和阳离子单体在自由基引发剂存在下和蛋白质表面双键发生原位 聚 合， 生长出包裹着蛋白质内核的高分子 外层。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 步骤 （1） 所述蛋白质为具有两个以上赖氨 酸残基的任意多肽， 所述 修饰为使用N ‑羟基琥珀酰 亚胺丙烯酸酯进行的丙烯酰 化修饰。 10.根据权利要求8所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （2） 所述不带电单体为丙烯酰 胺， 所述阳离子单体为2 ‑(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯， 所述 自由基引发剂为过硫酸铵和四 甲基乙二胺。 11.一种装载有药物分子的权利要求1 –7任一所述的纳米颗粒。 12.根据权利要求1 1所述的纳米颗粒， 其特 征在于， 所述药物分子为Cas9/sgRNA。 13.根据权利要求12所述的纳米颗粒， 其特征在于， 所述纳米颗粒： Cas9： sgRNA的摩尔 比为1:1:1。 14.权利要求12所述装载有Cas9/sgRNA的纳米颗粒的制备 方法， 所述方法包括： （1） 将所述Cas9蛋白与所述sgRNA混合形成Cas9/sgRNA复合物的步骤； （2） 将所述纳米颗粒与所述Cas9/sgRNA复合物混合形成自组装复合物的步骤。 15.权利要求12所述装载有Cas9/sgRNA的纳米颗粒在制备基因治疗药物中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115212321 A 2一种可降解纳米颗粒 及其介导 的Cas9/sgRNA 递送系统 技术领域 [0001]本发明公开了一种可降解纳米颗粒及其介导的Cas9/sgRNA递送系统， 属于纳米材 料领域。 背景技术 [0002]Cas9蛋白和sgRNA是近年来出现的颠覆性生物技术——CRISPR （规律成簇间隔的 短回文重复） /Cas9基因编辑中最关键的两个生物大分子， Cas9和sgRNA组成的复合物能够 对基因进行手术刀般精确切割。 与递呈需要在胞内表达Cas9和sgRNA的重组病毒或质粒相 比， 直接递呈Cas9/sgRNA复合物， 可以实现对基因编辑系统的胞内含量和作用时间的定量 调控， 减少外源DNA整合突变以及基因持续表达导致脱靶的风险， 增强了基因编辑的特异 性 和安全性。 然而， 与其它蛋白类生物大分子类似， Cas9/sgRNA胞内稳定性差、 递送效率低使 得将其递送至细胞核发挥功能成为一项巨大挑战。 目前已有的递送载体通常存在编辑效率 低下或合成路线复杂等问题。 此外， 对于原代T细胞这类尺寸很小的悬浮细胞， 使用现有的 递送载体很难进行转染， 而电转过程会对细胞膜造成不可逆的损伤而产生较大的细胞毒 性。 因此， 开发一个能解决上述限制的递送系统对于促进CRISPR基因编辑系统向临床上应 用和发展意 义重大。 发明内容 [0003]本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足， 提供一种新型的可降解纳米颗粒 作为Cas9/sgRNA的递送载体， 在细胞内化后能够有效地从其纳米自组装体中释放Cas9/ sgRNA， 从而实现较高的基因编辑效率。 [0004]基于上述目的， 本发明首先提供了一种由作为内核的蛋白质和作为外壳的高分子 形成的可降解纳米颗粒， 所述高分子是在所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基被修饰引入双键 后， 与不带电单体和阳离 子单体在自由基引发剂存在下原位聚合形成。 [0005]在一个优选的技术方案中， 所述阳离子单体为2 ‑(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯， 所 述不带电单体为丙烯酰胺， 所述自由基引发剂为过硫酸铵和四甲基乙二胺， 所述蛋白质中 赖氨酸的伯胺基的修饰为丙烯酰 化修饰。 [0006]在一个更为优选的技术方案中， 使用N ‑羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯进行所述蛋白质 中赖氨酸的伯胺基的修饰。 [0007]更为优选地， 所述蛋白质为具有两个以上赖氨酸残基的任意多肽。 [0008]在本发明一个具体的实施方案中， 所述蛋白质为牛血清白蛋白。 如本领域技术人 员所周知的， 只要修饰不干扰纳米颗粒 的合成， 化学修饰 （如荧光分子标记） 的多肽也被包 括在本发明的实施方案之中。 [0009]再为优选地， 所述纳米颗粒的红外光谱图具有以下波段的特征 吸收峰： 3317cm‑1、 2950cm‑1、 2820cm‑1、 2780cm‑1、 1730cm‑1、 1680cm‑1、 1540cm‑1、 1460cm‑1、 1395cm‑1和1148cm‑1。 [0010]尤为优选地， 所述牛血清白蛋白： 丙烯酰胺： 2 ‑(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯： 过硫说　明　书 1/9 页 3 CN 115212321 A 3