(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210847145.X (22)申请日 2022.07.19 (71)申请人 南开大学 地址 300300 天津市南 开区卫津路94 号 (72)发明人 刘书琳　李晓　王志刚　 (74)专利代理 机构 天津企兴智财知识产权代理 有限公司 12 226 专利代理师 石倩倩 (51)Int.Cl. A61K 47/69(2017.01) A61K 47/62(2017.01) A61K 39/395(2006.01) A61K 47/24(2006.01) A61K 47/28(2006.01) A61P 35/00(2006.01)A61K 31/4706(2006.01) (54)发明名称 一种仿乙型脑炎病毒纳米药物及其制备和 应用 (57)摘要 本发明构建了一种仿乙型脑炎病毒纳米药 物(JEV‑mimicking  nanodrugs， HCQ@aPDL1 ‑ Viro)及其制备和应用， 以脂质体为框架， 所述脂 质体表面修饰日本脑炎病毒膜蛋白和PDL1抗体， 脂质体框架内部包封羟氯喹。 本发 明的纳米药物 能够封锁免疫检查点重塑免疫抑制微环境， 激活 免疫细胞活性。 同时该纳米载体还能够上调细胞 自噬水平， 通过膜融合机制释放抑制剂， 阻断自 噬通量， 导致细胞失去稳态发生凋亡。 该发明的 纳米药物在封锁免疫检查点、 上调自噬水平和阻 断自噬通量的三重功效的协同作用下， 显著提高 了抗肿瘤疗效， 并为肿瘤治疗提供了一种潜在的 治疗策略。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 115120743 A 2022.09.30 CN 115120743 A 1.一种仿乙型脑炎病 毒纳米药物， 其特征在于： 以脂质体为框架， 所述脂质体表面修饰 乙型脑炎病毒膜蛋白和P DL1抗体， 同时内部包封有羟氯喹。 2.根据权利要求1所述的仿乙型脑炎病 毒纳米药物， 其特征在于： 所述纳米药物的水合 粒径为10 ‑200nm， 优选地， 所述纳米药物的水合粒径为120 ‑160nm。 3.权利要求1 ‑2任意一项所述的纳米药物的制备 方法， 其特 征在于： 包括如下步骤： (1)制备脂质薄膜； (2)向得到的所述脂质薄膜中加入硫酸铵溶液， 同时加入乙型脑炎病毒膜蛋白， 震荡水 合化， 然后挤压成型， 透析； (3)取出上述样品， 加入羟氯喹混合均匀， 置于恒温震荡箱中孵育， 然后在上述溶液中 加入PDL1抗体过夜孵 育， 得到纳米药物混合液； (4)将得到的所述纳米药物混合液进行 纯化， 收集纳米药物备用。 4.根据权利要求3所述的所述的纳米药物的制备方法， 其特征在于： 所述步骤(1)中制 备脂质薄膜包括如下具体步骤： 按照1 ‑棕榈酰基 ‑2‑油酰基卵磷脂(POPC):胆固醇(Chol): 鞘磷脂(SM):单唾液酸神经节甘脂(GM1):二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺 ‑聚乙二醇 ‑氨基(DSPE ‑ PEG‑NH2)＝30‑40:25‑35:25‑35:1‑5:2的摩尔比例将各磷脂加入样品瓶中， 旋干， 得到脂质 薄膜。 5.根据权利要求3所述的所述的纳米药物的制备方法， 其特征在于： 所述步骤(2)中硫 酸铵的浓度为100 ‑500mM， 乙型脑炎病毒膜蛋白的浓度为0.1 ‑0.5mg/mL， 振荡器震荡20 ‑30 分钟， 挤压成型时聚碳 酸酯膜的孔径为5 0nm‑200nm， 在氯化钠溶 液中透析。 6.根据权利要求3所述的所述的纳米药物的制备方法， 其特征在于： 所述步骤(3)中羟 氯喹的浓度为0.1 ‑5mg/mL， 恒温震荡箱温度为20 ‑40℃， 恒温震荡箱孵育时间为15 ‑60分钟， 过夜孵育温度为1 ‑5℃。 7.权利要求1 ‑2任意一项所述的纳米药物以及权利要求3 ‑6任意一项所述的制备方法 制备得到的纳米药物在肿瘤免疫 治疗的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115120743 A 2一种仿乙型脑炎病毒纳米药物及其制备和应用 技术领域 [0001]本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域， 尤其是涉及 一种仿乙型脑炎病毒纳 米药物及 其制备和应用。 背景技术 [0002]程序性死亡蛋白1(Programmed  death protein 1,PD‑1)是T细胞表面一种常见的 免疫抑制蛋白， 在下调免疫系统和 提高自我耐受中发挥不可或缺的作用。 而肿瘤细胞选择 性过表达其配体PD ‑L1， 会抑制 T细胞的功能， 使其无法杀死肿 瘤细胞， 导致肿 瘤免疫逃逸。 近年来， 使用PD ‑1/PD‑L1单克隆抗体阻断免疫检查点癌症免疫疗法已经彻底改变了多种恶 性肿瘤的临床效果。 然而， 单独阻断PD ‑1/PD‑L1信号往往不足以逆转肿瘤免疫抑制微环 境， 完全清除肿瘤细胞， 从而导致该免疫治疗在很大一部分患者中是无效的。 因此， 急需将PD ‑ 1/PD‑L1单克隆抗体与 协同药物相结合， 开 发更有效的联合疗法， 进一步提高肿瘤免疫治疗 的有效性。 [0003]自噬是一种进化保守 的细胞过程， 通过将受损的细胞器、 错误折叠 的蛋白质和其 他大分子运输到溶酶体降解和重复利用， 在细胞生存、 细胞代谢和免疫应答中发挥关键作 用。 其中， 自噬体与溶酶体的融合是自噬通量中的一个关键步骤。 自噬通量的阻断会导致异 常蛋白聚集的积累和线 粒体功能障碍， 促进氧化应激和细胞凋亡。 越来越多的证据 表明， 癌 细胞可以通过自噬增强自身代谢， 抑制细胞死亡途径， 从而促进肿瘤细胞存活。 研究发现 PD‑L1/PD‑1封锁后， 会刺激肿瘤细胞的自噬水平进一步提高， 从而促进细胞生存能力， 降低 免疫治疗的有效性。 因此， 阻断PD ‑L1/PD‑1相互作用， 同时抑制肿瘤细胞通过自噬增强自身 代谢途径(自噬通 量)， 有望提高P D‑1/PD‑L1检查点封锁癌症免疫 治疗的疗效。 [0004]乙型脑炎病毒(JEV， 也称日本乙型脑炎 或流行性乙型脑炎)是一种具有正链RNA基 因组的包膜黄病毒， 糖蛋白E介导 JEV的感染进入， 与细胞表 面的受体结合， 并在低pH下病毒 包膜与熟化内体膜融合释放基因组。 最近有报道发现， JEV感染可上调细胞自噬水平， 促进 细胞存活， 延长繁殖和复制时间。 值得注意的是， JEV可以逃避溶酶体降解而实现基因组胞 质释放， 这一机制可以使 药物逃脱溶酶体降解的命运， 最大限度地提高药物的递送效率， 解 决了一直以来药物递送面临溶酶体降解的难题。 发明内容 [0005]针对现有技术的不足， 本发明旨在提出一种仿乙型脑炎病毒纳 米药物及其制备和 应用， 纳米药物表面偶联的PDL1抗体为免疫检查点封锁剂， 可以激活T细胞免疫活性， 改善 免疫抑制微环境； 同时和病毒膜蛋白为自噬诱导剂， 能够刺激肿瘤细胞自噬水平上调， 有利 于肿瘤细胞的生存； 羟氯 喹HCQ为自噬通量抑制剂， 能够阻断刺激后肿瘤细胞中高水平的自 噬通量， 肿瘤细胞无法代谢， 导致 失去稳态， 从而发生凋亡。 总得来说， 该纳米药物具有封锁 免疫检查 点、 提高细胞自噬及阻断 自噬通量的三重作用来增肿瘤治疗效果。 [0006]为达到上述目的， 本发明的技 术方案是这样实现的：说　明　书 1/5 页 3 CN 115120743 A 3