(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211080597.6 (22)申请日 2022.09.05 (71)申请人 北京景达生物科技有限公司 地址 102600 北京市大兴区生物医药基地 华佗路50号院13号楼 (72)发明人 贾兴龙　韩瑞胜　张晓艳　黄园园　 杨月峰　郭雷鸣　王立燕　 (74)专利代理 机构 北京预立 生科知识产权代理 有限公司 1 1736 专利代理师 朱萍 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 35/17(2015.01)A61K 45/06(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 31/12(2006.01) A61P 37/02(2006.01) (54)发明名称 一种NK细胞的高效基因转 导方案 (57)摘要 本发明属于生物医药和生物 技术领域， 具体 涉及一种NK细胞的高效基因转导方案。 具体地， 提供了一种提高进行病毒转导时的转导效率的 细胞处理方法， 所述方法包括活化和/或促转导 的步骤， 所述活化所使用的培养基中至少含有细 胞因子IL ‑2、 IL‑15和IL‑1β， 所述促转导的培养 基中含有Polybrene和/或BX 795。 权利要求书2页 说明书9页 附图10页 CN 115466726 A 2022.12.13 CN 115466726 A 1.一种NK细胞的促转导培养基， 所述促转导培养基中含有促转导试剂， 所述促转导试 剂包括Vectofusi n‑1、 Polybrene、 BX 795、 Dext ran和Rosuvastati n中的1种或2种； 优选地， 所述促转导培养基是向含2000U/mL的IL ‑2和100ng/ml的IL ‑15的X‑VIV015培 养基中加入促 转导试剂； 优选地， 所述Vectofusi n‑1的浓度为2 μg/mL ‑20 μg/mL； 更优选地， 10 μg/mL； 优选地， 所述Po lybrene的浓度为1.0 μg/mL ‑10.0 μg/mL； 更优选地， 8 μg/mL； 优选地， 所述BX 795的浓度为0.0 5 μM‑1.0 μM； 更优选地， 0.1 μM； 优选地， 所述Dext ran的浓度为1.0 μg/mL ‑5.0 μg/mL； 更优选地， 2.0 μg/mL； 优选地， 所述Rosuvastati n的浓度为10 0.0 μM‑1.0 μM； 更优选地， 2.0 μM； 最优选地， 所述促转导培养基是向含有2000U/mL的IL ‑2和100ng/ml的IL ‑15的X‑ VIV015培养基中添加以下任意 一种促转导试剂： (1)8 μg/mL的Po lybrene和0.1 μM的BX 795； (2)0.1 μM的BX 795； (3)8 μg/mL的Po lybrene。 2.一种细胞因子组合， 所述细胞因子组合中包括IL2、 IL15， 所述细胞因子组合中还包 含IL‑1β 、 IL18和IL21中的一种或多种； 优选地， 所述细胞因子组合是由I L‑2、 IL‑15和IL‑1β 组成。 3.一种活化培 养基， 所述活化培 养基中含有权利要求2所述的细胞因子组合； 优选地， 所述活化培 养基的基础培 养基是X‑VIV015培养基； 优选地， 所述 IL‑2浓度为5 00‑2000U/mL； 更优选地， 20 00U/mL； 优选地， 所述 IL‑15浓度为20 ‑200ng/mL； 更优选地， 10 0ng/mL； 优选地， 所述 IL‑1β 浓度为20 ‑200U/mL； 更优选地， 10 0U/mL； 优选地， 所述 IL‑18浓度为10 ‑200ng/mL； 更优选地， 20ng/mL； 优选地， 所述 IL‑21浓度为10 ‑200ng/mL； 更优选地， 3 0ng/mL； 优选地， 所述细胞因子组合是由I L‑2、 IL‑15和IL‑1β 组成； 最优选地， 所述活化培养基是含2000U/mL的IL ‑2、 100ng/ml的IL ‑15和100U/mL的IL ‑1β 的X‑VIV015培养基。 4.一种提高进行病毒转导时的转导效率的细胞处理方法， 所述方法包括活化和/或促 转导的步骤； 优选地， 所述活化的步骤 包括使用权利要求3所述活化培 养基培养细胞； 优选地， 所述培 养持续2‑4天； 更优选地， 所述培 养持续2天； 优选地， 所述 促转导的步骤 包括使用权利要求1所述的促 转导培养基培养细胞； 优选地， 所述培 养持续1‑4小时； 最优选地， 4小时。 5.如权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述方法所针对的细胞包括从受试者样品中 分离的细胞或NK肿瘤 细胞系； 优选地， 所述受试者包括 健康者或癌症患者； 优选地， 所述样品包括外周血、 脐血、 iP SC； 更优选地， 所述样品为外周血； 优选地， 所述细胞 是经以下步骤处 理而得到的：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115466726 A 2(1)获得单个核细胞； 优选地， 获得 是外周血 单个核细胞； (2)诱导NK细胞： 使用含2000IU/ml的IL ‑2、 100ng/mL的IL ‑15、 100IU/mL的IL ‑12、 5 μg/ ml的CD137和10％灭活血浆的培 养基培养步骤1)得到的单个核细胞； (3)第一次补液： 第3天时， 向(2)的培养基中补充含有5％的灭活血浆、 2000IU/mL的IL ‑ 2、 100ng/mL的I L‑15、 100IU/mL的I L‑12的培养基； (4)第二次补液： 第5天时， 向(3)的培养基中补充含有5％的灭活血浆、 2000IU/mL的IL ‑ 2、 100ng/mL的I L‑15、 100IU/mL的I L‑12的培养基； 优选地， 所述细胞的步骤处理还包括步骤(5)第三次补液： 第7天时， 向(4)的培养基中 补充含有5％的灭活血浆、 2000IU/mL 的IL‑2、 100ng/mL的IL ‑15、 100IU/mL 的IL‑12的培养 基； 优选地， 以上步骤(1) ‑(5)的中所使用培 养基的基础培 养基是X‑VIVO15培养基； 优选地， 所述患 者是癌症患者， 所述癌症包括宫颈癌、 精原细胞瘤、 睾丸淋巴瘤、 前列腺 癌、 卵巢癌、 肺癌、 直肠癌、 乳 腺癌、 皮肤鳞状细胞癌、 结肠癌、 肝癌、 胰腺癌、 胃癌、 食 管癌、 甲 状腺癌、 膀胱移行上皮癌、 白血病、 脑瘤、 胃癌、 腹膜癌、 头颈癌、 子 宫内膜癌、 肾癌、 雌性生殖 道癌、 原位癌、 神经纤维瘤、 骨癌、 皮肤癌、 胃肠道间质瘤、 肥大细胞肿瘤、 多发性骨髓瘤、 黑 色素瘤、 胶质瘤。 6.如权利要求 4所述的方法， 所述病毒是重组慢病毒； 更优选地， 所述重组慢病毒包括基于VSV ‑G、 Baboon的重组慢病毒； 更优选地， 基于VSV ‑ G的重组慢病毒； 优选地， 所述重组慢病 毒的纯化方式包括柱层析纯化和超速离心纯化； 更优选地， 柱层 析纯化； 优选地， 重组慢病毒的感染 强度为1‑10MOI； 更优选地， 4MOI。 7.一种培养基组合， 所述培养基组合中包括权利要求3所述的活化培养基和权利要求1 所述的促 转导培养基。 8.权利要求7所述培养基组合中一种或多种培养基在使细胞被病毒转导 时具有高转导 效率中的应用。 9.权利要求 4所述方法制备 得到的细胞或其在制备基因修饰的NK细胞中的应用； 优选地， 所述NK细胞的激活性受体表达上调； 所述激活性受体包括CD69、 NKp30、 NKp44、 NKp46， 或者所述CD3 ‑CD56+细胞比例大于98％。 10.由权利要求4所述方法制备得到的细胞制成的基因修饰的NK细胞在制备药物、 药物 组合物中的应用； 优选地， 所述药物包括细胞治疗药物、 制备抗病 毒感染药物、 制备治疗癌症或自身免疫 性疾病的药物； 优选地， 所述细胞组合物中还包括抗体药物、 核酸药物、 小分子药物、 溶瘤病毒药物和 细胞药物。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115466726 A 3