(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211072530.8 (22)申请日 2022.09.02 (66)本国优先权数据 202210159193.X 202 2.02.22 CN (71)申请人 北京景达生物科技有限公司 地址 102600 北京市大兴区生物医药基地 华佗路50号院13号楼 (72)发明人 王立燕　李波　景浩然　黄园园　 杨月峰　郭雷鸣　 (74)专利代理 机构 北京预立 生科知识产权代理 有限公司 1 1736 专利代理师 朱萍 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) A61K 35/17(2015.01)A61K 45/06(2006.01) A61P 43/00(2006.01) A61P 31/12(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 37/02(2006.01) (54)发明名称 一种NK细胞扩大培 养的培养方案 (57)摘要 本发明属于生物 技术领域， 具体涉及一种NK 细胞扩大培养的培养方案。 本发明提供了一种NK 细胞的制 备方法， 所述方法包括在CD137、 CD28、 CD3预处理的细胞培养容器中使用激活培养基、 第一扩增培养基、 第二扩增培养基依次培养细 胞。 通过本发 明所提供的方法可以在高扩增倍数 下获得高纯度的NK细胞。 权利要求书3页 说明书14页 附图8页 CN 115369086 A 2022.11.22 CN 115369086 A 1.一种产品， 其特 征在于， 所述产品选自以下任意 一种： 1)一种抗体组合， 所述 抗体包括CD137、 CD28、 和/或CD3； 优选地， 所述 抗体是CD137、 CD28、 CD3的组合； 2)一种抗体包被液， 所述包被液中包括CD137、 CD28、 和/或CD3； 优选地， 所述CD137、 CD28、 CD3浓度是1:1:1； 优选地， 所述CD137的浓度为0 ‑10 μg/ml； 更优选地， 8 μg/ml； 优选地， 所述CD28的浓度为0 ‑10 μg/ml； 更优选地， 8 μg/ml； 优选地， 所述CD3的浓度为0 ‑10 μg/ml； 更优选地， 8 μg/ml； 3)一种激活培 养基， 所述培 养基中包括 IL‑2、 IL‑15、 IL‑12、 CD137、 血浆； 优选地， 所述 IL‑2、 IL‑15、 IL‑12的浓度比是20:10:1； 优选地， 所述 IL‑2浓度为10 00‑10000IU/mL； 10 00‑5000IU/mL； 更优选地， 20 00IU/mL； 优选地， 所述 IL‑15浓度为5 00‑2000IU/mL； 更优选地， 10 00IU/mL； 优选地， 所述 IL‑12浓度为5 0‑500IU/mL； 更优选地， 10 0IU/mL； 优选地， 所述CD137浓度为0 ‑10 μg/ml； 更优选地， 5 μg/ml； 优选地， 所述血浆体积占比3 ‑10％； 优选地， 5％； 4)第一扩增培 养基， 所述培 养基中包括 IL‑2、 IL‑15、 IL‑12、 血浆； 优选地， 所述 IL‑2、 IL‑15、 IL‑12的浓度比是20:10:1； 优选地， 所述 IL‑2浓度为10 00‑10000IU/mL； 10 00‑5000IU/mL； 更优选地， 20 00IU/mL； 优选地， 所述 IL‑15浓度为5 00‑2000IU/mL； 更优选地， 10 00IU/mL； 优选地， 所述 IL‑12浓度为5 0‑500IU/mL； 更优选地， 10 0IU/mL； 优选地， 所述血浆体积占比3 ‑10％； 优选地， 5％； 5)第二扩增培 养基， 所述培 养基中包括 IL‑2、 IL‑15、 IL‑21； 优选地， 所述 IL‑2、 IL‑15、 IL‑21的浓度比是40:20:1； 优选地， 所述 IL‑2浓度为10 00‑10000IU/mL； 10 00‑5000IU/mL； 更优选地， 20 00IU/mL； 优选地， 所述 IL‑15浓度为5 00‑2000IU/mL； 更优选地， 10 00IU/mL； 优选地， 所述 IL‑21浓度为20 ‑100IU/mL； 更优选地， 5 0IU/mL； 优选地， 所述激活培养基、 第 一扩增培养基、 第 二扩增培养基的基础培养基是无血清培 养基； 优选地， 所述无 血清培养基包括X ‑VIVO15、 TexMACS、 IMSF10 0； 优选地， 所述激活培养基、 第 一扩增培养基、 第 二扩增培养基的基础培养基各自独立地 是X‑VIVO15； 优选地， 所述血浆是灭活血浆或人 血白蛋白； 优选地， 所述血浆是自体血浆； 优选地， 所述单个核细胞来源于血 液、 脐血、 骨髓； 优选地， 所述血 液是外周血； 优选地， 所述单个核细胞 是由Fico ll密度梯度离心法方法制备 得到的。 2.一种预处理细胞培养容器的方法， 所述方法包括使用权利要求1所述的抗体包被液 处理细胞培 养容器。 3.经过权利要求2所述方法预处 理得到的细胞培 养容器。 4.权利要求1所述的产品、 权利要求3所述的细胞培 养容器在制备NK细胞中的应用。权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115369086 A 25.一种NK细胞的制备方法， 所述方法包括在权利要求3所述的细胞培养容器中使用权 利要求1所述的激活培养基培养单个核细胞， 所述方法还包括添加权利要求 1所述的第一扩 增培养基、 第二扩增培 养基进行细胞培 养； 优选地， 所述第一扩增培养基在第1 ‑7天添加； 更优选地， 所述第一扩增培养基在第3天 和第5天添加； 优选地， 所述第二扩增培养基在第7 ‑15天添加； 更优选地， 所述第二扩增培养基在第7 天、 第9天、 第1 1天、 第13天添加； 优选地， 每次添加培 养基后体积变为2倍、 3倍、 4 倍或更多。 6.如权利要求5所述的制备方法， 其特征在于， 所述方法包括在权利要求3所述的细胞 培养容器中使用权利要求1所述的激活培养基培养单个核细胞， 然后依 次按照以下方案进 行细胞培 养： 1)第3天时， 添加第一扩增培 养基， 终体积为初体积的3倍； 2)第5天时， 添加第一扩增培 养基， 终体积为初体积的9倍； 3)第7天时， 添加第二扩增培 养基， 终体积为初体积的27倍； 4)第9天时， 添加第二扩增培 养基， 终体积为初体积的54 倍； 5)第11天时， 添加第二扩增培 养基， 终体积为初体积的108倍； 6)第13天时， 添加第二扩增培 养基， 终体积为初体积的216倍。 7.如权利要求5或6所述的制备方法， 其特征在于， 所述单个核细胞来源于血液、 脐血、 骨髓； 优选地， 所述血 液是外周血。 8.权利要求5所述的制备 方法制备 得到的NK细胞。 9.一种包 含权利要求8所述 NK细胞的组合物； 优选地， 所述组合物是 药物组合物； 优选地， 所述药物 组合物包括以下任意一种或多种： 阿霉素、 长春新碱、 长春瑞滨、 紫杉 醇、 顺铂、 放线菌素、 博来霉素、 白消安、 卡培他滨、 卡铂、 卡莫司汀、 苯丁酸氮芥、 环磷酰胺、 阿糖胞苷、 柔红霉素、 表阿霉素、 依托泊甙、 足叶乙甙、 鬼臼乙叉甙、 氟阿糖腺苷酸、 氟尿嘧 啶、 吉西他滨、 赫赛汀、 羟基脲、 伊达比星、 异环磷酰胺、 依 立替康、 洛莫司汀、 环己亚硝脲、 美 法仑、 左旋苯丙氨酸氮芥、 巯基嘌呤、 氨甲蝶呤、 丝裂霉素、 米托蒽醌、 二羟基蒽酮、 奧沙利 铂、 丙卡巴肼、 甲基苄肼、 美罗华、 类固醇、 链佐星、 链脲霉素、 泰素帝、 硫鸟嘌呤、 噻替哌、 硫 替哌、 三胺硫磷、 雷替曲塞、 拓扑替康、 曲奧舒凡、 5 ‑氟尿嘧啶、 希罗达、 长春碱、 长春花碱、 长 春地辛、 长春瑞宾、 格列卫、 羟基喜树碱、 拉帕替尼、 Torisel、 舒尼替尼、 易瑞沙、 它赛瓦、 赫 赛汀、 阿瓦斯汀、 三氧化二砷、 反式维甲酸、 万珂、 替莫胺、 爱必 妥、 大沙替尼、 索拉非尼、 巾白 尼单抗、 替吉奧、 Ix empra、 利妥昔单抗、 替伊莫单抗、 托西莫单抗、 奥法木单抗、 奥瑞 珠单抗、 阿妥珠单抗、 达雷妥尤 单抗、 伊沙妥昔单抗、 Zo lbetuximab； 优选地， 所述药物组合物还 包括药学上可接受的载体、 稀释剂或赋 形剂。 10.权利要求8所述的NK细胞、 权利要求9所述的组合物在制备细胞治疗的药物、 制备抗 病毒感染的药物、 制备治疗癌症或自身免疫性疾病的药物中的用途； 所述用途还包括与抗体药物、 核酸药物、 小分子药物、 溶瘤病毒药物和细胞药物联合治 疗中的应用； 在NK细胞与放射治疗、 化疗 药物、 干细胞移 植手术、 介 入治疗、 消融治疗等治疗权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115369086 A 3