(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210526068.8 (22)申请日 2022.05.16 (71)申请人 西北农林科技大 学 地址 712100 陕西省咸阳市杨凌示范区 邰 城路3号 申请人 西安黄氏生物工程有限公司 (72)发明人 王强　秦铭　商文静　胡小平　 黄卫利　 (74)专利代理 机构 西安汇恩知识产权代理事务 所(普通合伙) 6124 4 专利代理师 毕波 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种基于RPA -CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝 菌的引物和试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种基于RPA ‑CRISPR/Cas12a 检测大丽轮枝菌的引物， 包括RPA上游引物、 RPA 下游引物、 crRNA1引物和Univ引物， 依次如 SEQIDNO:1 ‑4所示； 还提供了试剂盒， 包括基于 RPA‑CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物、 Cas12蛋白、 T7转录酶、 DNA聚合酶、 缓冲液、 Cas12/13专用核 酸检测试纸条； 还提供了检测方 法： 用RPA上、 下游引物建立RPA反应体系的建立， 得到RPA反应产物， 合成指导RNA的DNA模板， 合成 指导RNA， 用RPA反应产物和指导RNA建立CRISPR/ Cas12a反应体系， 得到RPA ‑CRISPR/Cas12a反应 产物， 用Cas12/13专用核酸检测试纸条检测。 本 发明方法具有易于操作、 快速灵敏、 鉴定结果准 确的特点。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 114774410 A 2022.07.22 CN 114774410 A 1.一种基于RPA ‑CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物， 其特征在于， 所述引物包括 RPA上游引物、 RPA下游引物、 crRNA1引物和Univ引物； 所述RPA上游引物的核苷酸序列如SEQ   ID NO:1所示； 所述RPA下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示； 所述crRNA1引物的核苷 酸序列如SEQ  ID NO:3所示； 所述Univ引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示； 所述大丽轮 枝菌的的拉丁文为Ver ticillium dahliae。 2.一种如权利要求1所述的基于RPA ‑CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌 的引物构建的用 于鉴定大丽轮枝菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括基于RPA ‑CRISPR/Cas12a检测大 丽轮枝菌的引物、 Cas12蛋白、 T7转录酶、 DNA聚合酶、 缓冲液、 Cas12/13专用核酸检测试纸 条。 3.一种如权利要求1所述的基于RPA ‑CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌 的引物检测大丽 轮枝菌的方法， 其特 征在于， 该 方法为： S1、 提取待测样品的基因 组DNA； S2、 用RPA上游引物和RPA下游引物对S1中提取的待测样品的基因组DNA在温度为37℃ 条件下进行靶标DNA扩增反应10mi n～20min， 得到RPA反应产物； 所述靶标DNA扩增反应的体系为： 待测样品的基因组DNA  5 μL、 10 μM的RPA上游引物2 μL、 10 μM的RPA下游引物 2 μL、 反应酶3 μL、 RAPID缓冲液25 μL、 无酶水补足至 50 μL； S3、 用crRNA1引物和Un iv引物对dNTP进行PCR扩增， 得到指导RNA的DNA模板； 所述PCR扩增的体系为： 10 ×Pfu Buffer 5 μL、 dNTP混合物4 μL、 crRNA1引物2 μL、 Univ引 物2μL、 4000U/mL的Pfu  DNA聚合酶0.25μL、 无酶水补足至50μL； 所述dNTP混合物为dATP、 dGTP、 dCTP和dT TP的混合物， 所述dATP、 dGTP、 dCTP和dT TP的浓度均为2.5mM； 所述PCR扩增的反正程序为： 94℃1min； 94℃30s， 56℃25s， 72℃35s， 30个循环； 72℃ 1min； 16℃保存； S4、 将S3中得到的指导RNA的DNA模板在温度为37℃的条件下反应1h～2h， 进行体外转 录， 合成指导RNA； 所述体外转录合成的反应体系为： 指导RNA的DNA模板5μL、 RNA酶抑制剂1μL、 10 × Transcription  Buffer 2 μL、 1000U/mL的T7  RNA聚合酶2 μL、 NTP 混合物4 μL、 无酶水补足至 20 μL； 所述 NTP混合物为ATP、 GTP、 CTP和T TP的混合物； S5、 使用RPA 反应产物和S4中得到的指导RNA 建立RPA‑CRISPR/Cas12a检测体系， 在温度 为37℃的条件下反应15mi n～60min， 得到RPA ‑CRISPR/Cas12a反应产物； 所述RPA‑CRISPR/Cas12a检测体系为： 10 ×NEB CutSmart Buffer 6 μL、 1 μM的Cas12a  6 μL、 300nM的指导RNA  18 μL、 无酶水26 μL、 1 μM的FB探针2 μL、 RPA反应产物 2 μL； 所述FB探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO:5所示； 所述FB探针进行5 ’ ‑异硫氰酸荧光素 FITC和3’ ‑生物素bi otin的修饰； S6、 将S5中得到的RPA ‑CRISPR/Cas12a反应产物用Cas12/13专用核酸检测试纸条检测， 2分钟～3 分钟后观察所述Cas12/13专用核酸检测试纸条检测的测试线的颜色变化； 当测试 线和质控线颜色变深， 则为阳性反应； 当只有质控线变色， 测试线处无颜色变化， 则为阴性 反应。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774410 A 2一种基于R PA‑CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物和试剂 盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于大丽轮枝菌检测技术领域， 具体涉及一种基于RPA ‑CRISPR/Cas12a检 测大丽轮枝菌的引物和试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]大丽轮枝菌(Verticillium  dahliae)作为轮枝菌属中最具破坏性的菌种， 可引起 农业上重要的黄萎病， 该病原菌寄主范围极广， 可侵染660多种植物， 涉及十字花科、 蔷薇 科、 豆科、 茄科、 唇形花科、 菊科等， 对世界范围内的主要经济作物包括番茄、 棉花、 草莓、 辣 椒、 生菜、 向日葵等造成巨大产量损失。 在中 国， 每年大约有250万 公顷的棉花遭受该病原菌 的侵染， 对棉花产量造成重要影响。 植物黄萎病 隶属于植物维管束病害且为典型 的土传病 害， 其病原菌的菌丝体可在维管束组织中定殖， 阻塞导管水分运输， 导致一系列发病症状， 如植株矮小、 生长发育不良、 叶片 萎蔫发黄、 维管束变褐等。 为应对不良环境条件， 大丽轮枝 菌在土壤中可产生黑褐色的休眠结构 “微菌核”， 该结构能够在土壤中存活长达10年。 微菌 核具有储藏养 分和抵抗不良环境的能力， 在遇到合适寄主或在适宜环境下会萌发产生菌丝 起始侵染。 当前研究表明每克土壤中含有1个微菌核即可造成作 物产量损失。 黄萎病属于单 循环病害， 大丽轮枝菌随寄主植物组织的坏死而产生大量微菌核散布在土壤中， 这些微菌 核可侵染下一季寄主植物造成积年流行病害。 大丽轮枝菌在世界范围内均有分布， 可通过 几种不同的方式进行局部或远距离传播。 病原体可随灌溉水或病菌土的转运造成短距离的 传播； 受病菌污染的种子或者组织材料可随种苗的调运而远距离传播。 由于大丽轮枝菌造 成的黄萎病已经是一个全球性的重要的病害， 因此快速、 灵敏的病原菌检测 技术有助于该 病害的综合防控。 [0003]目前， 比较常用的鉴定方法包括两种， 即以发病症状、 病原菌形态学为基础的传统 鉴定方法和基于目标基因的分子鉴定方法。 传统的发病症状识别法需要从业人员具有过硬 的病害识别、 病原菌鉴别特殊识别能力和丰富的病害识别经验； 而分子鉴定法所需的仪器 价格昂贵， 对操作人员的技 术要求较高。 发明内容 [0004]本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足， 提供一种基于RPA ‑ CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物和试剂盒及检测方法， 该方法具有易于操作、 快速灵 敏、 鉴定结果 准确等特点。 [0005]为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是： 一种基于RPA ‑CRISPR/Cas12a检 测大丽轮枝菌的引物， 所述引物包括RPA上游引物、 RPA下游引物、 crRNA1引物和 Univ引物； 所述RPA上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 所述RPA下游引物的核苷酸序列如SEQ   ID NO:2所示； 所述crRNA1引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示； 所述Univ引物的核苷酸 序列如SEQ  ID NO:4所示； 所述大丽轮枝菌的 的拉丁文为Ver ticillium dahliae。说　明　书 1/6 页 3 CN 114774410 A 3