(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210685840.0 (22)申请日 2022.06.16 (71)申请人 华中科技大 学 地址 430074 湖北省武汉市洪山区珞喻路 1037号 申请人 湖北光谷实验室 (72)发明人 焦振飞　付玲　 (74)专利代理 机构 华中科技大 学专利中心 42201 专利代理师 尹丽媛 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) G01N 21/01(2006.01) G01B 11/24(2006.01) G06T 17/00(2006.01) (54)发明名称 一种点扩散函数可编程的3D荧光成像方法 和系统 (57)摘要 本发明属于显微 成像领域， 涉及一种点扩散 函数可编程的3D荧光成像方法和系统， 包括在成 像物镜和荧光相机之间， 引入均与物镜后 焦面共 轭的可调孔径 光阑和相位调制器件， 改变物镜有 效数值孔径和物镜后 焦面相位分布， 改变成像物 镜的点扩散函数； 孔径光阑位于物镜后方， 且与 物镜后焦面共轭， 用于改变物镜有效数值孔径， 从而根据需求改变点扩散函数的轴向覆盖范围； 相位调制器件位于孔径光阑后方且同时与物镜 后焦面和可调孔径光阑共轭， 用来改变物镜后 焦 面相位分布， 以根据需求改变点扩散函数形状； 利用被调制成特定形状的点扩散函数进行三维 重建得到样 本三维结构。 本发明解决了成像端点 扩散函数形状无法改变导致成像分辨率、 3D重建 效果无法改变的问题。 权利要求书3页 说明书12页 附图4页 CN 115184317 A 2022.10.14 CN 115184317 A 1.一种点扩散函数 可编程的3D荧 光成像方法， 其特 征在于， 包括： 产生从上到下照 射到样本不同深度的激发光光束， 以同时激发样本不同深度位置的荧 光； 通过在成像物镜和荧光相机之间， 引入均与成像物镜后焦面共轭的可调孔径光阑和相 位调制器件， 分别来改变所述成像物镜的有效数值孔径和物镜后焦面的相位分布， 进而改 变成像物镜的点扩散函数； 其中， 所述可调孔径 光阑位于所述成像物镜后方， 且与成像物镜 的后焦面共轭， 用于改变所述成像物镜的有效数值孔径， 从而根据所需探测 位置改变点扩 散函数的轴向连续覆盖范围； 所述相位调制器件位于所述可调孔径光阑的后方， 且同时与 所述成像物镜的后焦面和可调孔径光阑共轭， 用来改变成像物镜后焦面的相位分布， 从而 根据所需探测位置强化或弱化点扩散函数的部 分轴向覆盖范围； 所述成像物镜位于样本上 方， 用于收集 荧光信号； 根据被调制成的特定的点扩散函数， 以及相机上收集到的来自样本不同深度荧光信号 的叠加图像， 进行三维重建， 得到样本的原 始三维结构。 2.根据权利要求1所述的一种点扩散函数可编程的3D荧光成像方法， 其特征在于， 所述 相位调制器件具体为空间光调制器或可变形镜 。 3.根据权利要求1所述的一种点扩散函数可编程的3D荧光成像方法， 其特征在于， 所述 改变成像物镜后焦面的相位分布， 具体实现方式为： 根据所需探测的样本深度 范围， 得到所需的具有多个子焦点的点扩散函数， 其中， 所述 多个子焦点均匀分布于所述深度范围内； 所述具有多个子焦点的点扩散函数中每个子焦点 i对应的特 征为： PSFi＝Wx‑倾 斜PSFx‑倾 斜+Wy‑倾 斜PSFy‑倾 斜+Wz‑离焦PSFz‑离焦； 其中， Wx‑倾斜和Wy‑倾斜分别为控制子焦点在x,y轴方向倾斜程度PSFx‑倾斜、 PSFy‑倾斜的权重； Wz‑离焦为控制子焦点在z轴方向离焦程度PSFz‑离焦的权重； 改变权重Wx‑倾斜和Wy‑倾斜， 以改变子焦 点倾斜程度， 捕 获样本角空间信 息； 改变权重Wz‑离焦， 以针对所需探测的样本深度 范围， 灵活 配置子焦点位置， 优化 三维重建效果； 利用傅里叶光学理论， 通过为相位调制器件上每个子孔径区域分配不同的权重， 进行 区域子孔径相位合成， 最终生成相位调制 器件上所需的相位分布， 以用于实现所述所需的 具 有 多 个 子 焦 点 的 点 扩 散 函 数 ，其 中 ，每 个 子 孔 径 区 域 相 位 表 示 为 其中， 和 分别为控制每个子孔径区域 中两个维度倾斜项 和 以及离焦项 的相位所占的权重大小， 和 为泽尼 克多项式 中n和m取不同数值情况 下的表达式； 根据所述所需的相位分布， 改变加载到空间光调制器上面每个像素上的 电压， 进而改 变该像素对 入射光的相位延迟， 从而调制成像物镜后焦面的相位分布。 4.根据权利要求1所述的一种点扩散函数可编程的3D荧光成像方法， 其特征在于， 利用 三维的图像反卷积算法和对应的不同深度成像点扩散函数， 对样本不同深度的荧光信号进 行重建， 得到样本的三维结构。 5.一种点扩散函数可编程的3D荧光成像系统， 其特征在于， 包括： 样本照明装置， 点扩 散函数可编程的成像装置， 以及成像结果处 理装置；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115184317 A 2所述样本照明装置用于产生从上到下照 射到样本不同深度的激发光光束， 以同时激发 样本不同位置的荧 光； 所述点扩散函数可编程的成像装置包括成像物镜、 可调孔径光阑和相位调制器件； 所 述可调孔径光阑位于成像物镜和相位调制器件的中间， 并与成像物镜后焦面和相位调制器 件表面共轭， 用于调节成像物镜的有效数值孔径， 从而根据所需探测位置改变点扩散函数 的轴向覆盖范围； 所述相位调制器件位于成像物镜和 孔径光阑之后， 并与成像物镜后焦面 和可调孔径光阑共轭， 用于可编程的调制物镜后焦面的相位分布， 从而根据所需探测位置 强化或弱化点扩散函数 的部分轴向覆盖范围； 所述成像物镜位于样本的上方， 用于 收集样 本发射出来的荧 光信号； 所述成像结果处理装置用于结合点扩散函数的三维空间分布信 息， 以及相机上收集到 的来自样本不同深度荧 光信号的叠加图像， 重建样本三维结构。 6.根据权利要求5所述的一种点扩散函数可编程的3D荧光成像系统， 其特征在于， 所述 样本照明装置包括： 光源和照明镜筒透 镜； 所述光源， 用于 激发样本产生 荧光； 所述照明镜筒透镜， 和所述点扩散函数可编程的成像装置中的成像物镜组成4f系统， 用于将入射 光源以平行光的状态 送入样本空间， 照亮整个样本 。 7.根据权利要求5所述的一种点扩散函数可编程的3D荧光成像系统， 其特征在于， 所述 点扩散函数可编程的成像装置包括： 成像物镜， 中继透镜组1， 可调 孔径光阑， 偏振片， 中继 透镜组2， 相位调制器件， 以及相机； 所述成像物镜， 用于收集样本被激发的、 来自不同深度的荧 光； 所述中继透镜组1， 用于将 成像物镜的后焦面共轭到可调孔径光阑表面， 并提供放大倍 数， 使得物镜后焦面的尺寸在可调孔径光阑的有效范围内； 所述偏振片， 用于将不具有偏振态的荧光， 变成具有单一偏振态的偏振光， 并使得其偏 振方向平行于相位调制器件的光轴， 从而可以被相位调制器件进行相位调制； 所述中继透镜组2， 用于将与物镜后焦面共轭的可调孔径光阑的平面进一步共轭到相 位调制器件表面， 从而使得三个平面互相共轭； 通过改变加载到相位调制器件上每个像素 的电压， 对成像物镜的后焦面进行相位调制， 从而改变成像物镜点扩散函数的形状； 所述相机， 用来接收最终来自样本不同深度且卷积了各深度对应点扩散函数的荧光信 号。 8.根据权利要求5所述的一种点扩散函数可编程的3D荧光成像系统， 其特征在于， 所述 相位调制器件具体为空间光调制器或可变形镜 。 9.根据权利要求5所述的一种点扩散函数可编程的3D荧光成像系统， 其特征在于， 所述 点扩散函数 可编程的成像装置包括 点扩散函数计算装置； 用于根据所需探测的样本深度 范围， 得到所需的具有多个子焦点的点扩散函数， 其中， 所述多个子焦点均匀分布于所述深度范围内； 所述具有多个子焦点的点扩散函数中每个子 焦点i对应的特 征为： PSFi＝Wx‑倾 斜PSFx‑倾 斜+Wy‑倾 斜PSFy‑倾 斜+Wz‑离焦PSFz‑离焦； 其中， Wx‑倾斜和Wy‑倾斜分别为控制子焦点在x,y轴方向倾斜程度的权重； Wz‑离焦为控制子焦 点在z轴方向离焦程度的权重； 改变Wx‑倾斜和Wy‑倾斜的权重， 以改变子焦 点倾斜程度， 捕获样本 角空间信息； 改变Wz‑离焦权重， 以针对所需探测的样本深度范围， 配置 子焦点位置；权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115184317 A 3