甲壳动物重要病原体微阵列基因芯片检测方法 MethodofDNAmicroarrayfordetectionofimportantpathogensincultured crustacean  中国国际科技促进会 发布T/CI157-2023CIICS65.020.30 CCSB50/59 团体标准 2023-9-28发布 2023-9-28实施 全国团体标准信息平台 T/CI157-2023 II前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》 起草。 某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中国国际科技促进会标准化工作委员会提出。 本文件归口中国国际科技促进会。 本文件起草单位：省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室、浙 江正合谷生物科技有限公司、中国水产科学研究院黄海水产研究所，宁波大学海洋学院、 自然资源部第一海洋研究所、青岛南凌生物科技有限公司、山东北游生物科技有限公司、 浙江逸泽水产养殖有限公司、象山蓝尚海洋科技有限公司、礼蓝（四川）动物保健有限公 司、礼蓝（上海）动物保健有限公司、宁波市鄞州咸祥皓海水产养殖场。 本文件主要起草人：苏秀榕、周君、王印庚、叶欢、陈炯、李成华、史西志、韩姣姣、 曲凌云、李晔、芦晨阳、明庭红、张真、王中华、李来国、伊祥华、徐嘉杰、孙思志、朱 永江、翟婷婷、石晓辉、钱鹏宇、张春丹、彭少杰、蒋继远。 全国团体标准信息平台 T/CI157-2023 III引言 人工养殖甲壳类动物的重要病原体包括病毒、细菌和寄生虫。如对虾白斑综合征病毒、 传染性皮下和造血组织坏死病毒、十足目虹彩病毒、传染性肌坏死病毒、桃拉病毒、黄头 病毒、罗氏沼虾诺达病毒、对虾偷死野田村病毒、虾肝肠胞虫和带有致病性质粒的副溶血 弧菌等。这些是人工养殖甲壳动物的重要病原体，可对虾蟹养殖业造成严重的经济损失。 因此，利用微阵列基因芯片高通量检测病原体，将促进虾蟹养殖业的健康发展。 本文件由省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室组织实施。 本文件为首次发布，今后将根据水产养殖病害的检测和社会需求情况适时修订。 全国团体标准信息平台 T/CI157-2023 1甲壳动物重要病原体微阵列基因芯片检测方法 1范围 本文件规定了虾白斑综合征病毒、传染性皮下和造血组织坏死病毒、十足目虹彩病毒、 传染性肌坏死病毒、桃拉病毒、黄头病毒、罗氏沼虾诺达病毒、对虾偷死野田村病毒、虾 肝肠胞虫和带有致病性质粒的副溶血弧菌10种重要病原体的微阵列基因芯片检测技术，该 方法适于不同生活周期的甲壳动物，也适于它们的流行病学调查、诊断、检疫和监测工作。 2规范性引用文件 文中引用的文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日 期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改本）均 适用于本文件。 GB/T27990-2011生物芯片基本术语 GB/T28639-2012DNA微阵列芯片通用技术条件 GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088-2000出入境动物检疫采样 GB/T40249-2021斑节对虾杆状病毒病诊断规程PCR检测法 GB/T28630.2-2012白斑综合征（WSD）诊断规程.第2部分：套式PCR检测法 GB/T25878-2010对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）检测PCR法 GB/T40257-2021桃拉综合征诊断规程RT-PCR检测法 SC/T7011.2-2021水生动物疾病术语与命名规则第2部分：水生动物疾病命名规则 SC/T7233-2020急性肝胰腺坏死病诊断规程 SC/T7237-2020虾虹彩病毒病诊断规程 SC/T7238-2020对虾偷死野田村病毒（CMNV）检测方法 SC/T7236-2020对虾黄头病诊断规程 SC/T7228-2019传染性肌坏死病诊断规程 SN/T4348-2015螯虾瘟检疫技术规范 SN/T3583-2013白尾病检疫技术规范 SC/T7103-2008水生动物产地检疫采样技术规范 全国团体标准信息平台 T/CI157-2023 23术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 荧光标记Fluorescencelabeling 将荧光基团（荧光素）共价连接到蛋白、核酸等分子上的过程。常用的荧光素有异硫 氰酸荧光素、羟基荧光素、四氯荧光素、罗丹明类染料、菁染料、香豆素类、吖啶类、芘 类等。 3.2 非荧光标记Non-fluorescencelabeling 将能直接产生颜色反应的物质共价连接到蛋白、核酸等分子上的过程。常用的非荧光 标记物有碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、过氧化物酶、纳米金等。 3.3 DNA分子杂交技术DNAhybridizationtechnology 又称DNA探针技术。是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性， 对某一特异性DNA序列进行探查的新技术。 3.4 DNA微阵列芯片DNAmicroarray 在基片表面以微阵列形式将DNA分子和(或)类DNA分子固定作为探针的微型器件。 4缩略语Abbreviation WSSV：对虾白斑综合征病毒（Whitespotsyndromevirus） IHHNV：传染性皮下和造血组织坏死病毒（Infectioushypodermalandhematopoietic necrosisvirus） IDIV：对虾虹彩病毒I型（InfectiouswithdecapodiridescentvirusI） IMNV：传染性肌坏死病毒（Infectiousmyonecrosisvirus） TSV：桃拉病毒（Taurasyndromevirus） YHV：黄头病毒（Yellowheadvirus） MrNV：罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachiumrosenbergiinodavirus） CMNV：对虾偷死野田村病毒（Covertmortalitynodavirus） EHP：虾肝肠胞虫（Enterocytozoonhepatopenaei） 全国团体标准信息平台 T/CI157-2023 3AHPND：急性肝胰腺坏死病（Acutehepatopancreaticnecrosisdisease），其病原体是携 带致病性质粒副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus,Vp） SSC：枸橼酸钠水溶液（Salinesodiumcitrate） SDS：十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate） ddH2O：双蒸水（DoubledistilledH2O） NBT/BCIP：氯化硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐对甲苯胺（Nitro-blue- tetrazoliumchloride/5-bromo-4-chloro-3-indolyphosphatep-toluidine） 5检测原理 从虾蟹特定组织样品中提取核酸（取样组织视不同物种病原体而定。检测RNA病毒 需在提取核酸后，将RNA反转录成cDNA），利用带有荧光或非荧光物质标记的特异性引 物进行PCR扩增，其产物与微阵列基因芯片上的探针进行杂交，清洗后荧光标记的微阵列 基因芯片用激光扫描仪扫描和结果判定。非荧光标记微阵列基因芯片与碱性磷酸酶标记的 链霉亲和素结合后，NBT/BCIP显色，再用生物芯片检测仪扫描和结果判定。 6仪器设备与试剂材料 6.1仪器设备 PCR扩增仪 恒温金属浴（30-100℃） 离心机（转速≤16000rpm） 烘箱 高压灭菌锅 漩涡振荡器 电泳仪和水平电泳槽 凝胶成像分析系统 激光扫描仪 生物芯片检测仪 杂交盒（4，6，10矩阵） 湿盒 6.2主要试剂和材料 全国团体标准信息平台 T/CI157-2023 4以下试剂如非特殊说明，均为分析纯。实验用水符合GB/T6682-2008《分析实验室用 水规格和试验方法》，所有试剂均用无RNA酶的容器分装。 6.2.1核酸提取试剂 细菌、寄生虫和病毒DNA和RNA提取均使用相对应的试剂盒，并按照操作说明进行。 6.2.2DNA检测试剂 琼脂糖、核酸染料、DL2000DNAMarker、TAE电泳缓冲液。 6.2.3PCR扩增试剂 荧光标记试剂：2×PCRMix预混液、5’端标记Hex的引物。 非荧光标记试剂：2×PCRMix预混液、5’端标记Biotin的引物。具体配方见附录B.1。 6.2.4杂交试剂 3×杂交液、PC-Hex、PC-Biotin的配方见附录B.2。 6.2.5显色试剂 链霉亲和素标记的碱性磷酸酶抗体、抗体液、抗体稀释液、显色液（NBT/BCIP碱性 磷酸酶溶液），其中抗体液、抗体稀释液的配方见附录B.3。 6.2.6无菌ddH2O ddH2O在121℃±2℃条件下，高压灭菌20min，冷却至常温后无菌分装。 6.2.7基因芯片 引物、探针、阳性质控、阴性质控的核酸序列和探针的排布见附录A的表A1、A2和 图A3。 7取样 7.1样品采集 选取人工养殖的虾和蟹等，根据不同病原体的采样和检测需要，按照本标准引用的对 应病原体检测规范文件中的要求进行。取样部位包括头、壳、肌肉、消化系统或病灶，每 次取样量为200mg左右。 全国团体标准信息平台 T/CI157-2023 57.2样品的运输与保存 按照GB/T18088-2000《出入境动物检疫采样》进行采样，样品应在4-8℃的环境中运 输，实验室接收样品后应尽快检测，如暂时不能检测，应将样品置于-80℃冰箱中保存。 8基因芯片