! 7 ,     江苏省市场监督管理局 发　布 中 国 标 准 出 版 社 出　版淡水生物环境 DNA监测技术方法 Technical method for environmental DNA monitoring of freshwater organisms 2023 ⁃09⁃22发布 2023 ⁃10⁃22实施CCS Z 06 DB32/T 4539—2023ICS 13.020 DB32/T 4539—2023 前言…………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ 1 范围………………………………………………………………………………………………………… 1 2 规范性引用文件 …………………………………………………………………………………………… 1 3 术语和定义 ………………………………………………………………………………………………… 1 4 监测点位布设 ……………………………………………………………………………………………… 3 5 监测频次与时间 …………………………………………………………………………………………… 4 6 试剂和材料 ………………………………………………………………………………………………… 4 7 仪器和设备 ………………………………………………………………………………………………… 5 8 环境 DNA宏条形码监测内容和方法 ……………………………………………………………………… 5 9 质量控制与质量保证 ……………………………………………………………………………………… 9 10 废弃物处理 ……………………………………………………………………………………………… 10 附录 A （资料性）环境 DNA固定剂………………………………………………………………………… 11 附录 B （资料性）常用淡水生物 DNA条形码扩增引物信息 …………………………………………… 12 附录 C （规范性）淡水生物 DNA条形码构建方法 ………………………………………………………… 14 附录 D （资料性）生物统计表 ……………………………………………………………………………… 17 附录 E （规范性）野外质量控制与保证 …………………………………………………………………… 18 附录 F （规范性）实验室质量控制与保证 ………………………………………………………………… 19 参考文献 ……………………………………………………………………………………………………… 21目　　次 Ⅰ DB32/T 4539—2023 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由江苏省生态环境厅提出并归口 。 本文件起草单位 ：江苏省环境监测中心 、南京大学 。 本文件主要起草人 ：张咏、张效伟、杨雅楠、杨江华、蔡琨、王晨波、吕学研、李婧慧、张丽娟、钟文军、 侍昊、朱晨、毛成责、卜亚谦、范帆。 Ⅲ DB32/T 4539—2023 淡水生物环境 DNA监测技术方法 1 范围 本文件规定了利用环境 DNA技术监测淡水生物的采样 、试剂和材料 、仪器和设备 、监测内容和步 骤，以及质量控制与保证 。 本文件适用于生态环境监测领域湖泊 、水库、溪流、河流、河口区等水域浮游植物 、浮游动物 、着生藻 类、大型底栖无脊椎动物和鱼类等淡水生物物种组成及相对丰度的监测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB 19489　实验室　生物安全通用要求 GB/T 20001 .4　标准编写规则　第 4部分：试验方法标准 GB/T 29859　生物信息学术语 GB/T 30989　高通量基因测序技术规程 GB/T 34265　Sanger法测序技术指南 GB/T 35890　高通量测序数据序列格式规范 GB/T 37874　核酸提取纯化方法评价通则 GB/T 40226　环境微生物宏基因组检测　高通量测序法 HJ 91.2　地表水环境质量监测技术规范 HJ 494　水质　采样技术指导 HJ 710.7　生物多样性观测技术导则　内陆水域鱼类 HJ 710.8　生物多样性观测技术导则　淡水底栖大型无脊椎动物 HJ 1216　水质　浮游植物的测定　 0.1 ml计数框 ⁃显微镜计数法 HJ 1295　水生态监测技术指南　河流水生生物监测与评价 （试行） HJ 1296　水生态监测技术指南　湖泊和水库水生生物监测与评价 （试行） SC/T 9402　淡水浮游生物调查技术规范 SN/T 4835　实验室生物废弃物管理要求 DB 21/T 2777 海洋浮游微藻分离和筛选技术规程 DB 32/T 4178　河流水生态监测规范 3 术语和定义 GB/T 20001 .4、GB/T 29859和GB/T 30989界定的以及下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 淡水生物 freshwater organisms 生活在各类淡水生境中的生物 。 1 DB32/T 4539—2023 注： 主要的淡水生物类群包括浮游植物 、浮游动物 、大型底栖无脊椎动物和鱼类等 。 3.2 环境 DNA　environmental DNA ；eDNA 环境介质 （水、土壤、沉积物、生物膜、空气等）或混合生物组织中存在的脱氧核糖核酸 （DNA）等生物 遗传物质 。 3.3 DNA 条形码 DNA barcode 生物体细胞核或者细胞器中能够代表该物种的 、有足够变异的 、易扩增的短 DNA序列，可用于物种 的识别和鉴定 。 [来源：SN/T 4278 —2015，3.1，有修改 ] 3.4 引物 primer 在DNA复制过程中 ，结合于模板链上并提供 DNA合成起点 ，具有一定长度和顺序的寡核苷酸链 。 3.5 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction ；PCR 一种体外酶促合成特异 DNA片段的分子技术 ，由高温变性 、低温退火及适温延伸等组成一个周期 ， 循环进行 ，使目的 DNA得以迅速扩增 ，具有特异性强 、灵敏度高 、操作简便省时等特点 。 3.6 Sanger测序 Sanger sequencing 用于基因测序的双脱氧末端终止法 ，在链延伸过程中利用荧光标记双脱氧碱基随机阻断 ，产生以 A/T/G/C结束的四组不同长度的核苷酸链 ，通过读取荧光信号实现对核酸碱基序列信息的读取 。 3.7 遗传距离 genetic distance 群或分类单元间的遗传差异程度 ，可以通过遗传标记如 DNA条形码的序列差异来表示 。 3.8 高通量测序 high⁃throughput sequencing 区别于传统 Sanger（双脱氧链末端终止法 ）测序，能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定 的技术。 [来源：GB/T 30989 —2014，3.19，有修改 ] 3.9 16S核糖体 DNA　16S ribosomal DNA ；16S rDNA 原核生物编码核糖体小亚基 rRNA的DNA序列。 3.10 18S核糖体 DNA　18S riboso mal DNA；18S rDNA 真核生物编码核糖体小亚基 rRNA的DNA序列。 3.11 线粒体12S 核糖体 DNA　mitochondrial 12S ribosomal DNA ；Mt 12S rDNA 后生动物线粒体编码 12S rRNA 的DNA序列。 3.12 线粒体细胞色素 c氧化酶 I　mitochondrial cytochrome c oxidase I ；COI 后生动物线粒体编码细胞色素 c氧化酶 I的DNA序列。 3.13 DNA 宏条形码 DNA metabarcoding 利用高通量测序获取环境 DNA中特定的 DNA片段，根据 DNA序列差异识别物种 ，获取物种组成 2 DB32/T 4539—2023 和群落结构 。 3.14 标签 tag 通过 PCR或文库准备过程中为每个样品添加一个短序列的核苷酸碱基对 ，允许多个样品在一个高 通量测序运行中被汇集 。 注： 这个序列对于同一个运行中的每个样本都是不同的 ，并使序列能够在测序后分配回它们来自的样本 。 3.15 序列相似性 sequence similarity 反映序列间相似程度的数值 ，即序列间相同 DNA碱基数目所占的比例 。 注： 一般以百分数表示 。 [来源：SN/T 4278 —2015，3.8，有修改 ] 3.16 序列相似性阈值 cutoff value of sequence similarity 判定两条 DNA序列是否为同一分类单元的最小序列相似值 。 3.17 扩增序列变体 amplicon sequence variants ；ASV DNA宏条形码技术中 ，通过生物信息学剔除 PCR扩增和测序产生的错误序列后形成的独特 DNA 序列，即任意两条序列间至少有一个碱基存在差异 。 3.18 操作分类单元 operational taxonomic unit ；OTU DNA宏条形码测序数据按照一定的序列相似性阈值进行聚类