ICS 65. 020. 30 CCS B 41 DB65 新疆维吾尔自治区地方标准 DB 65/T 4669—2023 小反鱼兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重 实时荧光定量PCR检测方法 Detection method of peste des petits ruminants virus and orf virus by duplex real-time fluorescence quantitative PCR 地方标准信息服务平台 2023 - 07 - 20 发布 2023 -09－ 20 实施 新疆维吾尔自治区市场监督管理局 发布 地方标准信息服务平台 DB 65/T 4669—2023 前言 本文件按照GB/T1.1--2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心提出。 本文件由新疆维吾尔自治区畜牧兽医局归口并组织实施。 本文件起草单位：新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心、中国动物疫病预防控制中心、北京亿 森宝生物科技有限公司、新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）、新疆生 产建设兵团畜牧兽医工作总站。 本文件主要起草人：马晓艳、孙雨、王文、刘亚涛、惠志华、王新杰、夏俊、马伟、李舵、苏贵成、 苏晓慧、薛文、秦菊、努尔麦麦提阿穆提、居马别克夏拉巴依、马亚珍、符玉涓、艾日登才次克、李 璐、张丹、沙那瓦尔塔希、任娟、美热木古丽巴依待拉提、乌那尔汗吉斯汗、孙晓明、冯冰、陈玲、 高姗姗、颜成旭、陆桂丽、茹仙古丽木明、加米拉、加伊娜古力、特列克库拉别克。 本文件实施应用的疑问，请反馈至新疆维吾尔自治区畜牧兽医局（乌鲁木齐市新华南路408号、新疆 维吾尔自治区动物疾病预防控制中心（新疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区蓝天路268号）、中国动物疫 病预防控制中心(北京市大兴区天贵大街17号)、北京亿森宝生物科技有限公司(北京市北京经济技术开 发区（通州)科创东五街2号)、新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）（新 疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区冬融街726号）、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站(新疆乌鲁木齐 市米东区米东南路2188号红光雅居小区7号公建楼）、新疆维吾尔自治区市场监督管理局（新疆乌鲁木齐 市新华南路167号）。 对本文件的修改意见建议，请反馈至新疆维吾尔自治区畜牧兽医局（乌鲁木齐市新华南路408号、新 疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心（新疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区蓝天路268号）、中国动物 疫病预防控制中心(北京市大兴区天贵大街17号)、新疆维吾尔自治区市场监督管理局(新疆乌鲁木齐市 新华南路167号）。 新疆维吾尔自治区畜牧兽医局联系电话：0991-8568089；传真：0991-8527722；邮编：830004 新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心联系电话：0991-4626082；传真：0991-4641491；邮编： 830013 中国动物疫病预防控制中心联系电话：010-59198917，传真：010-59198917；邮编：100125 北京亿森宝生物科技有限公司联系电话：010-67832149，传真：010-65502970；邮编：100176 新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话：0991-2818750；传真：0991-2311250；邮编：830004 “息服务平台 地方标准信息服务平台 DB 65/T 4669—2023 小反兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重 实时荧光定量PCR检测方法 1范围 本文件规定了小反兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重实时荧光定量PCR检测方法的试剂和引物、 仪器用具与耗材、实验步骤、检测结果的判定。 本文件适用于新疆小反台兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒的核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4试剂和引物 处规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验室用水应符合GB/T6682的规定执行；pH7.4磷 酸盐缓冲液（PBS）溶液配制应符合GB/T27982的规定；DNA/RNA提取相关试剂见附录A，实时荧光PCR 地方标 检测引物探针见附录B。 5仪器用具与耗材 高速冷冻离心机、电子天平、高通量核酸提取仪、荧光定量PCR仪、-20℃低温冰箱和-80℃超低温 冰箱、高通量研磨仪、pH计、高压灭菌锅、生物安全柜、微量振荡器、瞬时离心机、可调移液器（10μL， 20μL，100 μL，200μL，1000 μL）和对应的无RNA灭菌可调移液器吸头、无RNA灭菌离心管、研磨管、 服务平台 吸附柱等。 6操作步骤 6.1样品的采集、存储 6.1.1拭子样品 选择处于发热期（体温40℃～41℃）、排出脓性、浆液性眼分泌物、出现口腔溃疡症状的活畜采 集样品，采集眼结膜拭子2个、鼻粘膜拭子2个，分别置于4℃条件下保存的1000μL灭菌磷酸盐缓冲液 1 DB 65/T 4669—2023 （0.01mo1/LpH7.4，PBS）中。将含有渗出物的棉拭子在微量振荡器上充分混合，捻动、挤压干后弃 去拭子。12000r/min离心5min，吸取上清300μ于1.5mL灭菌离心管中，编号备用。 6.1.2全血样品 按照常规方法抽取2mL～3mL血液，放置含有EDTA-Na抗凝剂的5mL试管中，编号备用。 6.1.3组织样品 选择刚被扑杀或者死亡时间不超过24h的病畜采集组织样品。无菌采集肠系膜和支气管淋巴结各3 个～4个，脾、胸腺、肠粘膜和肺组织各约25g～50g，分别置于50mL离心管或密封袋中。每份组织分 别从三个不同位置取样，称取样品约1g，用手术剪剪碎的样品混匀后取0.1g装入研磨管，于高通量研 r/min，离心2min，取上清300uL，编号备用。拭子、全血、组织样品的采集与处理均应符合GB19489 的规定。 6.2样品存储 6.2.1拭子样品 样品采集后，放置有冰盒的采样箱里送至实验室，在24h内进行检测。 6.2.2组织样品 样品采集后，储存应置于-70℃冰箱。 6.3DNA/RNA的提取 6.3.1取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600山，充分颠倒混匀，室温静置3 min~5 min。 6.3.2将液体吸入吸附柱中，12000r/min离心30S。 6.3.3弃去收集管中液体，加入600μ洗涤液，12000r/min离心30s。 6.3.4重复上述步骤6.3.3。 6.3.5弃去收集管中液体，12000r/min离心2min，以除去残留的洗涤液。 6.3.6将吸附柱移入新的1.5mL无菌离心管中，向柱中央加入洗脱液60μL。 6.3.7室温静置2min，12000r/min离心1min，离心管中液体为核酸模板。得到的核酸模板尽量在 2h内进行实时荧光扩增，若需长时间保存须放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融。 息服务平台 6.3.8若使用核酸提取仪提取核酸，则按DNA/RNA提取试剂盒说明书进行操作。 6.4试剂准备 6.4.1试验前20min从-20℃冰箱中取出试剂盒等相应试剂，使试剂完全溶解。 6.4.3盖紧PCR反应管盖后将PCR反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-20℃冰箱冷冻保存 6.5加样（样本准备区） 6.5.1分别向上述PCR反应管中加入已提取样本核酸模板各5μL，阳性对照和阴性对照核酸模板各加 5μL，记录加样顺序。 2 DB65/T4669—2023 6.5.2盖紧管盖，瞬时离心30S，PCR样本管转移至扩增区。 6.6荧光PCR检测 6.6.1开机预热，检查仪器性能。 6.6.2将PCR反应管放在样品槽中相应位置，填写原始记录单。 6.6.3PCR扩增 6.6.4设置扩增参数，PPRV-FAM通道采集荧光信号；ORFV-HEX通道采集荧光信号。荧光PCR反应程序 为：45℃10min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃15s，60℃45s，40个循环，在每 次循环的退火时收集荧光。检测过程中应分别设立阴性对照、阳性对照。以含小反兽疫病毒、羊传染 性脓疱病毒阳性质粒作为阳性对照，同时以双蒸水代替模板作为阴性对照。分别提取样品和对照品的 DNA/RNA进行实时荧光PCR检测。检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果。 6.7结果判定 6.7.1结果分析条件设定 直接读取检测结果。合理调整阈值线，阈值设定可根据仪器噪音情况进行调整。 6.7.2对照结果的判定 6.7.2.1阴性对照：无扩增曲线且Ct值>38或无Ct值。 6.7.2.2阳性：Ct值≤30，有明显指数增长，呈典型的S型曲线。 6.7.2.3以上：Ct值≤30，有明显指数增长，呈典型的S型曲线。 7检测结果的判定 7.1阳性 若被检样本的PCR反应体系通道出现2条典型扩增曲线，且Ct值≤35，则判定样本中同时存在小反台 兽疫病毒和羊传染性脓疱病毒核酸。若在"FAM"标记下出现典型的扩增曲线且Ct值≤35，则判定样本中 小反台兽疫病毒核酸阳性。若在“HEX"标记下出现典型的扩增曲线且Ct值≤35，则判定样本中羊传染性 脓疱病毒核酸阳性。小反台兽疫病毒与羊传染性脓疱病毒双重实时荧光定量PCR检测典型扩曲线示意图 见附录B.2。 7. 2阴性 若被检样本的PCR反应体系通道无典型扩增曲线，且Ct值>38或无Ct值，则判定样本小反乌兽疫病 毒和羊传