ICS 59.080.99 CCS W09 0B65 新疆维吾尔自治区地方标准 DB65/T4644——2023 固废纺织原料中大肠埃希氏菌的 快速检验方法 Rapid detection method of Escherichia coli in solid waste textile materials 地方标准信息服务平台 2023-07-20发布 2023-09-20实施 新疆维吾尔自治区市场监督管理局 发布 地方标准信息服务平台 DB65/T46442023 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由乌鲁木齐海关提出。 本文件由乌鲁木齐海关归口并组织实施。 本文件起草单位：乌鲁木齐海关技术中心、成都海关、新疆师范大学、新疆环疆绿源环保科技有限 公司。 本文件主要起草人：巴哈提古丽.马那提拜、刘俊、巩志国、王、高沙尔.卡依尔哈力、刘冬志、 塔伊尔·买买提江、万永亮、王静静、房芳、张伟、车娟、王洁、白梅花、王斌、范伟功、谢伟、张 飞宇、刘秀玲。 本文件实施应用中的疑问，请咨询乌鲁木齐海关海关技术中心。 对本文件的修改意见建议，请反馈至乌鲁木齐海关技术中心（乌鲁木齐市南湖北路116号）、乌鲁 木齐海关（乌鲁木齐市北京南路295号）、新疆维吾尔自治区市场监督管理局（乌鲁木齐市新华南路167 号）。 乌鲁木齐海关技术中心联系电话：0991-3616817；邮编：830063 乌鲁木齐海关联系电话：0991-3267855；邮编：830011 新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话：0991-2817197：邮编：830004 地方标准信息服务平台 DB65/T4644—2023 引 言 目前大多固废纺织原料加工过程中仅靠添加抗菌剂和防腐剂来抑制其携带的微生物的增殖，并不 能全面有效杀死其携带的有害微生物，因此固废类纺织原料存在较大的生物安全隐患。 经查资料和调研，受到污染的固废纺织原料可能携带感染性和致病性较强的大肠埃希氏菌。微生物 常规培养和分离方法费时费力，操作复杂，周期较长。为快速检验固废纺织原料中的大肠埃希氏菌， 特制定本文件。 地方标准信息服务平台 II DB 65/T4644—2023 固废纺织原料中大肠埃希氏菌的 快速检验方法 1范围 本文件规定了固废纺织原料中大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）的术语和定义、缩略语、原理、 设备和材料、培养基和试剂，描述了检验程序、操作步骤、结果报告的方法。 本文件适用于固废纺织原料中大肠埃希氏菌的快速检验。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 文件。 GB4789.6食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 GB19489 实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T4835实验室生物废弃物管理要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 固废纺织原料solidwastetextilematerial 天然纤维和化学纤维在纺织生产过程中受到机械作用和化学反应影响，失去原有用途，不能在原生 产工序中继续使用的部分，包括废棉、废棉纱线、废化学纤维、废麻原料、废丝绸原料、废动物毛、废 标准信息服务平台 矿物纤维等。 4缩略语 下列缩略语适合于本文件 1）dATP：脱氧腺苷三磷酸，deoxyadenoside triphosphate 2) dCTP：脱氧胞苷三磷酸，deoxycytidinetriphosphate 3) dGTP：脱氧鸟苷三磷酸，deoxyguanosidetriphosphate 4) dNTP：脱氧核苷三磷酸，deoxyribonucleosidetriphosphate 5) dTTP：脱氧胸苷三磷酸，deoxythymidinetriphosphate 6) EB：溴化乙锭 7) PCR：聚合酶链反应，Polymerase chain reaction 8) Taq 酶：Taq DNA 聚合酶 9) TE：Tris-EDTA缓冲液 DB65/T4644—2023 1o）uidA：β-葡萄糖醛酸酶基因，β-glucuronidasegene 5原理 利用大肠埃希氏菌发酵乳糖产酸产气、特异性生物酶β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）、 分解5溴-4氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷环已基胺盐产生游离5溴-4氯-3-吲哚基的特性，在 大肠埃希氏菌发酵乳糖产酸条件下呈蓝绿色的沉淀物，初筛判断大肠埃希氏菌存在可能；编码β-葡 萄糖醛酸酶的uidA基因分布于几乎所有大肠埃希氏菌体内，属于大肠埃希氏菌的特异性保守基因， 因此选用该保守基因的引物，对初筛可疑的样品提取DNA，在一定条件下进行PCR扩增，扩增产物放 置在电场当中，在一定的电场强度下，不同分子以不同的速度迁移，从而分离出目标DNA片段，与 DNA分子量标记物比对，确定样品中是否存在目标菌。 6设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 冰箱：2℃～5℃ b) 恒温水浴箱：44.5℃ ±0.2℃ c) 天平：感量为0.1g d) 拍击式均质器 e) 漩涡振荡器 f) 低温高速离心机：转速≥12000r/min，控温4℃～8℃ g) PCR 仪 h) 微量移液器：0.5μL～2μL，2μL～20μL，20μ～200μL，200μL～1000 μL i）电泳仪 i) 凝胶成像仪 j) 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器1）无菌 锥形瓶：容量500mL 微量离心管：1.5mL或2.0mL 地方标准信息服务平台 k) 1) 接种环 7培养基和试剂 使用的培养基和试剂如下： a) 生理盐水：应符合附录A中A.1的要求 b) 改良EC肉汤：应符合附录A中A.2的要求 c) 无菌1mol/LNaOH：应符合附录A中A.3的要求 (P 无菌1mol/LHCl：应符合附录A中A.4的要求 e) TE（pH8.0）：应符合附录A中A.5的要求 f) 10×PCR反应缓冲液：应符合附录A中A.6的要求 g) 50XTAE电泳缓冲液：应符合附录A中A.7的要求 h) 6×上样缓冲液：应符合附录A中A.8的要求 i) 25mmo1/LMgC12 j) dNTPs：dATP、dTTP、dGTP、dCTP每种浓度为2.5mmo1/L 2 DB65/T4644—2023 k) 5U/μLTaq酶 1) 引物：引物序列应符合附录B中B.1的要求 m) 琼脂糖 n) EB或Sybergreen等核酸染料 0) DNA分子量标记物（100bp-2000bp） p) 凝胶染色液浓度（0.5μg/mL） 8检验程序 大肠埃希氏菌的定性检验程序见图1 检样10g+200mL生理盐水 取10mL 改良EC肉汤50mL 44.5℃±0.2℃24h±2h 不产气、不产蓝绿色沉淀物 产气、产蓝绿色沉淀物 地方标准 PCR确认试验 息服务平台 报告 图1大肠埃希氏菌的定性检验流程图 操作步骤 9.1 样品制备 3