ICS 65.020.01 CCS B 05 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2801—2022 F•Owen 型甜菜细胞质类型快速鉴定技术 规程 Technical code of practice for rapid identification of cytoplasmic types of F • Owen type sugar beet 2022-08-30 发布 2022-09-30 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2801—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人：王良、张自强、付增娟、张辉、韩平安、鄂圆圆、赵尚敏、张必周、白晨、李 晓东、张惠忠、郑文哲、吴新荣、梁亚晖、常悦、唐宽刚、孙瑞芬、张立华、乔慧蕾。 I DB15/T 2801—2022 F·Owen 型甜菜细胞质类型快速鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了F·Owen型甜菜细胞质类型快速鉴定技术的仪器、试剂及引物、样品制备、样品检测、 细胞质基因型鉴定、结果分析。 本文件适用于F·Owen型甜菜细胞质类型快速鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 F·Owen 型甜菜 F·Owen sugar beet 是由F·Owen于1945年发现的核质互作雄性不育型甜菜。 O 型系 maintainer line 即为保持系，是指作为父本与不育系杂交时，能使F1代保持雄性不育性的甜菜品系。 4 材料、仪器及试剂 仪器 本规程用到的仪器：移液器、台式高速离心机、陶瓷研钵、紫外分光光度计、电泳仪、凝胶成像系 统、PCR仪。 试剂 4.2.1 50 mmol/L EDTA pH 8.0 (1 L:800 ml H2O 中加 186.1 g EDTANa2·2 H2O,用 NaOH 调 pH 至 8.0， 定容至 1 L，灭菌)。 4.2.2 50 × TAE 缓冲液(1 L：500 ml H2O 中加 242 g Tris，溶解后加 100 ml l0.5 mol/L EDTA pH 8.0 和 57.1 ml 冰乙酸，定容)。 TR1 引物的序列 1 DB15/T 2801—2022 TR1: 5'-AGAACTTCGATAGGCGAGAGG-3' 5'-GCAATTTTCAGGGCATGAACC-3' 5 样品制备 材料选取 选取拟鉴定甜菜生长期的新鲜幼嫩叶片，单株装入塑封袋，放入有冰袋的低温取样盒中。 样品处理 将样品洗净擦干，称取0.5 g，放入研钵，倒入液氮，迅速将样品研成粉末，装入1.5 ml离心管中， 并快速加入裂解液。 DNA 提取 按所选取植物全基因组DNA提取试剂盒的说明进行DNA提取。 6 样品检测 DNA 含量和质量检测 取15 μL DNA样品稀释20倍，利用紫外分光光度计测定OD260/OD280，检测DNA的含量及质量。纯DNA： OD260/OD280≈1.8（大于1.9，表明有RNA污染；小于1.6，表明有蛋白质、酚等污染）。对于纯的样品，只 要读出260 nm的A值即可算出含量。通常以A值为1相当于50 μg/ml双螺旋DNA。 DNA 电泳检测 取5 μL DNA样品， 使用1%琼脂糖凝胶在1×TAE电泳缓冲液中电泳，电泳电压120 V，电泳时长25 min～ 35 min，用凝胶成像系统观察DNA质量。 7 甜菜细胞质基因型鉴定 PCR 体系 用ddH2O将DNA样品稀释到40 ng～50 ng，反应体系25 μL，其中DNA模板1 μL、上下游TR1引物各1 μL、MIX 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。 PCR 程序 94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃进一 步延伸10 min，4 ℃+∞；4 ℃保存。 阳性对照设置 进行细胞质类型鉴定时，使用O型和CMS型纯系甜菜DNA模板作为阳性对照。 电泳检验 2 DB15/T 2801—2022 取PCR产物5 μL，使用1%琼脂糖凝胶在1×TAE电泳缓冲液中电泳，电泳电压120 V，电泳时长30 min。 用凝胶成像系统紫外光下检测电泳结果。 8 结果分析 结果分析见图1所示是对部分材料进行PCR电泳检测部分结果，泳道M为DL 2000 Marker,泳道1、3、 4、5、6条带位置在750 bp，细胞质类型为N型，为具有保持能力O型材料；2、7、8、9、10、11、12条 带位置在500 bp，细胞质类型为S型，为CMS型材料，泳道1、2是一对标准的不育系及其保持系材料，做 为对照组。 图1 部分材料 PCR 电泳结果示意图 3