ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2796—2022 25 羟基维生素 D 判定产后奶牛子宫疾病发 病技术规程 Technical regulations for determining the incidence of uterine disease in postpartum dairy cows with 25 hydroxyvitamin D 2022-08-30 发布 2022-09-30 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2796—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、宁夏大学、西北农林科技大学。 本文件主要起草人员：马燕芬、张春华、羿静、宝华、特日格勒、刘瑞芳。 I DB15/T 2796—2022 25 羟基维生素 D 判定产后奶牛子宫疾病发病技术规程 1 范围 本文件规定了25羟基维生素D判定产后奶牛子宫疾病发病技术规程的术语和定义、检测方法和判定 标准。 本文件适用于奶牛场以及畜牧工作者对产后奶牛子宫疾病发病的判定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 干奶期 dry-off 奶牛在产犊前的一段时期内停止挤奶，使乳房、奶牛机体得到休整的过程。干奶期通常为45 d～75 d，平均为60 d。对初产牛、高产牛及瘦牛可适当延长干奶期，可延长为65 d～75 d；对体况较好、产 奶量低的牛，可缩短为45 d。 围产期 transition period 奶牛产前21 d至产后21 d。其中，产前21 d称为围产前期，产后21 d称为围产后期。 尿酮 urine ketone 尿中的酮体，是脂肪酸在肝脏内正常分解代谢的中间产物，包括乙酰乙酸（acetoacetic acid， ACAC）、丙酮（acetone）和β-羟丁酸（beta hydroxybutyric acid，BHBA）。 注： 通常只测定乙酰乙酸来判定产前奶牛尿酮浓度升高。 25 羟基维生素 D 25-hydroxyvitamin D 25(OH)D 维生素D在体内的主要存在形式，维生素D为类固醇衍生物，属于脂溶性维生素。维生素D在肝脏中 通过羟基化作用转化为25-羟基维生素D，然后在肾脏中转换为具有活性的1，25-二羟基维生素D。通过 测定血清25羟基维生素D可反映机体内维生素D的储存水平。 1 DB15/T 2796—2022 胎衣不下 retained placenta 胎衣滞留，是指胎衣未在胎儿娩出后24 h内排出的一种家畜产科疾病。 子宫炎 metritis 分娩后母牛子宫松弛，收缩不正常，并在产后21 d内出现异常阴道分泌物的一种家畜产科疾病。 4 检测方法 检测设备、试剂和耗材 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 酶联免疫吸附（ELISA）试剂。 酶标仪（450 nm）。 加样器和枪头。 37 ℃水浴锅。 血样采集及血清分离 采集干奶期15 d～18 d，围产前期13 d～15 d，围产后期5 d～10 d奶牛尾静脉血3 mL置于5 mL真 空采血管中，室温静置半小时，打开离心机，3500 rpm离心15 min，分离得到血清。 测定指标 25(OH)D。 测定步骤 4.4.1 从室温平衡 20 min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4 ℃冰箱。 4.4.2 标准品稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔 10 孔，在第 1 孔和第 2 孔中分别加标准品 100 μL，然后在第 1 孔和第 2 孔中分别加标准品稀释液 50 μL，混匀后从第 1 孔和第 2 孔中各取 100 μL 分 别加到第 3 孔和第 4 孔；在第 3 孔和第 4 孔中分别加标准品稀释液 50 μL，混匀后在第 3 孔和第 4 孔中 先各取 50 μL 弃掉，再各取 50 μL 分别加到第 5 孔和第 6 孔中；再在第 5 孔和第 6 孔中分别加标准品 稀释液 50 μL，混匀后从第 5 孔和第 6 孔中各取 50 μL 分别加到第 7 孔和第 8 孔中；再在第 7 孔和第 8 孔中分别加标准品稀释液 50 μL，混匀后从第 7 孔和第 8 孔中分别取 50 μL 加到第 9 孔和第 10 孔中； 再在第 9 孔和第 10 孔中分别加标准品稀释液 50 μL，混匀后从第 9 孔和第 10 孔中各取 50 μL 弃掉（稀 释后各孔加样量均为 50 μL，浓度分别为 60 μg/L、40 μg/L、20 μg/L、10 μg/L、5 μg/L）。 4.4.3 加样：分别设空白孔（不加样品及酶标试剂）、待测样本孔，在待测样品孔中先加样品稀释液 40 μL，然后再加待测样品 10 μL（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不 触及孔壁，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37 ℃孵育 30 min。 4.4.4 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释 30 倍后备用。 4.4.5 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，用吸水纸去除多余水分，每孔加满洗涤液，静置 30 s 后弃 去，用吸水纸去除多余水分，如此重复洗板 5 次。 4.4.6 加酶：每孔加入酶标试剂 50 μL，空白孔除外，37 ℃孵育 30 min。 4.4.7 洗涤：操作同 4.4.5。 2 DB15/T 2796—2022 4.4.8 显色：每孔先加入显色剂 A50 μL，再加入显色剂 B50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色 15 min。 4.4.9 终止：每孔加入终止液 50 μL，终止反应（此时蓝色立即转变为黄色）。 4.4.10 测定：以空白孔调零，450 nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后 15 min 内进行。 4.4.11 计算：OD 值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数 5，即为样品的实际浓度。 5 判定标准 根据产犊后奶牛发病特点、临床症状可对干奶期和围产期奶牛作出初步诊断，经测定血清25(OH)D 浓度予以确诊，可判定奶牛产前尿酮浓度增加，产后子宫疾病患病风险增加。干奶期和围产前期奶牛尿 酮浓度升高与围产后期奶牛患子宫疾病风险增加的判定按照表1进行。 表1 干奶期和围产前期奶牛尿酮浓度升高与围产后期奶牛子宫患病风险增加预警值 25(OH)D 浓度（ng/mL） 结果判定 干奶期 ≥ 100 尿酮浓度增加 围产前期 ≥ 90 尿酮浓度增加 围产后期 ≤ 70 患子宫疾病风险增加 3