ICS 65.020.30 CCS B 41 13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 5625—2022 规模化奶牛场布鲁氏菌病净化技术规范 2022 - 08 - 10 发布 2022 - 09 - 10 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB 13/T 5625—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由河北省农业农村厅提出。 本文件起草单位：河北省畜牧兽医研究所、河北省动物疫病预防控制中心、唐山市动物疫病预 防控 制中心。 本文件主要起草人：王晓芳、邵丽玮、徐华、郭建军、马宏伟、刘天驹、顾文源、符乐、孙凤 莉、薄玉琨、李惠敬、邳明伟、刘嫣然、冯曼、刘泽、崔雪霞、李彦龙、张晓利。 I DB 13/T 5625—2022 规模化奶牛场布鲁氏菌病净化技术规范 1 范围 本文件规定了规模化奶牛场布鲁氏菌病的实验室检测、净化检测、净化标准和净化维持等技术 要求。 本文件适用于规模化奶牛场布鲁氏菌病的净化，其他类型的奶牛场布鲁氏菌病净化可参考执行。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 18646 动物布鲁氏菌病诊断技术 NY/T 1467 奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术 NY/T 5049 无公害食品 奶牛饲养管理准则 《畜禽标识与养殖档案管理办法》（2006年农业部令第67号） 《布鲁氏菌病防治技术规范》（农医发〔2007〕12号） 《病死及病害动物无害化处理技术规范》（农医发〔2017〕25号） 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 实验室检测 血清学 4.1.1 血清 4.1.1.1 样品要求 血清来自布鲁氏菌病非免疫奶牛，使用A19疫苗皮下注射接种超过18个月或使用S2疫苗口腔喷服 接种超过6个月的奶牛。 4.1.1.2 检测方法 虎红平板凝集试验（RBT），试管凝集试验（SAT），间接酶联免疫吸附试验（i-ELISA），竞争 酶联免疫吸附试验（c-ELISA），补体结合试验（CFT），按GB/T 18646-2018执行。 对于不符合4.1.1.1要求的血清，采用琼脂凝胶免疫扩散试验（NH-GD）进行鉴别检测，方法见 附录A。 4.1.2 乳样 4.1.2.1 样品要求 新鲜全乳或混合乳来自布鲁氏菌病非免疫奶牛，使用A19疫苗皮下注射超过18个月或使用S2疫苗 口腔喷服接种超过6个月的奶牛，不得为初乳、脱脂乳、煮沸过的乳、冻结乳、腐败乳、酸化乳、乳 房炎及其他乳房疾病患病牛的乳样。 4.1.2.2 检测方法 采用全乳环状试验（MRT），按GB/T 18646执行。 病原学 1 DB 13/T 5625—2022 4.2.1 样品要求 流产胎儿可无菌采集胎衣、羊水、肝、脾、淋巴结、胃内容物等；流产母牛可无菌采集乳汁、阴 道分泌物等。采样过程应当采取措施防止病原微生物扩散。 4.2.2 检测方法 采用聚合酶链式反应（PCR），按NY/T 1467执行。 感染判定 4.3.1 对临床健康奶牛，采用 RBT 或 i-ELISA、MRT 中任一方法，检测结果阳性的判为疑似感染阳 性。 4.3.2 对临床健康奶牛，采用 SAT、c-ELISA、CFT 中任一方法检测结果阳性的，判为感染阳性。 4.3.3 对免疫布鲁氏菌病疫苗未超过 4.1.1.1 中接种时间的临床健康奶牛，采用 NH-GD 检测结果阳 性的，判为感染阳性。 4.3.4 对流产母牛、流产胎儿，采用 4.2.2 检测结果阳性的，判定为病例。 5 净化检测 本底调查 按照预期感染率3%、置信度95%确定随机抽样数量，并根据泌乳牛、干乳牛、后备牛存栏数量按 比例分配，覆盖到每个栋舍。 技术路线 5.2.1 牛群布鲁氏菌病感染率<2%，循环检测，隔离淘汰患病牛或感染阳性牛。 5.2.2 牛群布鲁氏菌病感染率≥2%，可接种布鲁氏菌疫苗，跟踪检测感染率<2%后停止免疫，并按 5.2.1 执行。 方法组合 5.3.1 串联检测 对于感染率≥2%的奶牛群或在净化初期，采用 i-ELISA 或 RBT、MRT 方法检测初 筛，结果阳性的样品采用 c-ELISA 或 SAT、CFT 方法检测确诊。推荐 i-ELISA 初筛、c-ELISA 确诊组 合。 5.3.2 并联检测 对于感染率<2%的奶牛群或在净化后期，采用 i-ELISA、RBT、MRT、c-ELISA 等两 种以上方法平行检测，任一方法检测结果阳性或可疑视为感染阳性牛。 检测频率 5.4.1 外引牛 引入前在输出地检测一次，引入后隔离 45 d～60 d，混群前再检测一次。 5.4.2 流产牛 对流产母牛进行血清学检测，对流产物进行病原学检测。 5.4.3 感染牛群 每隔 2～4 个月普检一次，连续三次检测均为阴性视为假定净化牛群。 5.4.4 假定净化牛群 每隔 4～6 个月普检一次，连续两次检测均为阴性，视为净化牛群。检出感 染阳性牛时按 5.4.3 执行。 5.4.5 净化牛群 每隔 3～6 个月抽检一次，参照 5.1 执行，检出感染阳性牛时按 5.4.3 执行。 6 净化标准 连续2年以上无布鲁氏菌病临床病例，布鲁氏菌抗体检测阴性；具备维持净化状态的生物安全及 管理条件。 7 净化维持 种源管理 7.1.1 国内引进种用牛、乳用牛、精液、胚胎，应来源于取得《种畜禽生产经营许可证》的单位， 2 DB 13/T 5625—2022 优先选择“国家级布鲁氏菌病净化场”。 7.1.2 国外引进活牛、精液、胚胎应具有国务院农业农村主管部门签发的审批意见及出入境检验检 疫系统出具的《入境货物检验检疫证明》。 追溯管理 奶牛佩戴耳标、建立档案符合《畜禽标识与养殖档案管理办法》要求，保证可追溯到奶牛个体。 人员管理 7.3.1 本场职工无布鲁氏菌病等人畜共患病，定期体检并取得健康证明。 7.3.2 不得将生鲜的牛羊肉、乳等风险产品带入场区。 7.3.3 从事接触奶牛、污染物等感染材料的工作时，做好个人防护。 消毒管理 消毒工作按照NY/T 5049要求执行。 无害化处理 患病牛和感染阳性牛按《布鲁氏菌病防治技术规范》扑杀。被扑杀牛、病死牛、流产物、污染物 等按《病死及病害动物无害化处理技术规范》处理。 3 DB 13/T 5625—2022 A A 附 录 A （规范性） 布鲁氏菌抗体琼脂凝胶免疫扩散试验 A.1 原理 光滑型布鲁氏菌经三氯乙酸提取获得2种抗原，一种是脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），另 一种是称为天然半抗原（Native Hapten，NH）的多聚糖。LPS抗原免疫原性强，自然菌和疫苗菌均 可刺激机体产生LPS抗体。NH抗原免疫原性弱，自然菌感染尤其在活动期或排菌期持续强烈刺激机体 产生NH抗体，而疫苗菌很难产生NH抗体。抗原与血清抗体均可在琼脂凝胶上扩散，结合形成复合物 时在琼脂界面出现可见沉淀线。LPS抗原分子量大、扩散慢，沉淀线则靠近抗原端，NH抗原分子量小、 扩散快，沉淀线则靠近被检血清端。据此可以鉴别自然感染抗体和疫苗免疫抗体。 A.2 材料 A.2.1 仪器与耗材 恒温恒湿培养箱，10 μL～100 μL的移液器及吸头。 A.2.2 试剂 布鲁氏菌病抗体琼脂凝胶免疫扩散试剂盒，包含琼脂平板、LPS和NH混合抗原、阳性对照血清和 阴性对照血清。 A.2.3 被检血清 牛的新鲜血清。 A.3 操作步骤 A.3.1 A.3.2 A.3.3 A.3.4 A.3.5 A.3.6 将试剂盒恢复至室温； 在琼脂平板的中心孔加入15 μL LPS和NH混合抗原（图1“Ag”孔）； 在琼脂平板周围孔的其中一孔加入15 μL阳性对照血清（图1“＋”孔） ； 在琼脂平板周围孔的另一孔加入15 μL阴性对照血清（图1“−”孔）； 在琼脂平板周围孔的剩余孔每孔加入15 μL被检血清（图1“1～4”孔） ； 将琼脂平板置于恒温恒湿培养箱，22 ℃±3 ℃孵育24 h～48 h后观察结果。 图1 加样示意图 A.4 结果判定 4 DB 13/T 5625—2022 A.4.1 当“＋”孔与“Ag”孔之间出现两条明显致密的沉淀线（靠近“Ag”孔的沉淀线为LPS抗原抗 体复合物，靠近“＋”孔的沉淀线为NH抗原抗体复合物） ，而“−”孔与“Ag”孔之间无沉淀线时（图 2所示）试验成立，否则应重新进行试验。 图 2 阳性对照和阴性对照结果示意图 A.4.2 当被检血清孔与“Ag”孔之间出现两条明显致密的沉淀线（如图3中的“2”孔）时，判定该 孔血清为布鲁氏菌自然感染抗体阳性；当被检血清孔与“Ag”孔之间仅在靠近“Ag”孔出现一条明 显致密的沉淀线（如图3中的“4”孔）时，判定该孔血清为布鲁氏菌疫苗免疫抗体阳性；当被检血清 孔与“Ag”孔之间未出现沉淀线时（如图3中的“1”、“3”孔），判定该孔血清为布鲁氏菌病抗体阴 性。 图 3 不同被检血清结果示意图 5