ICS 71.100.70 C2682 Y42 上海日用 化学品行业协会 团体标准 T/SHRH 0 11-2018 _________________________________________________________________________________________ 化妆品 眼刺激性测试 鸡胚绒毛尿囊膜试验 Cosmetics Eye irritation Test - HET-CAM Test 2018-12-01发布 2018-12-30实施 上海日用化学品行业协会 发布 1 目 次 前言…………………………………………………………………………… ……………… 2 1.范围…………………………………………………………………………… …………… 3 2.规范性引用文件 ……………………………………………………… …………… ……… 3 3. 术语和定义 ………………………………………… …………………… ………………… 3 4.原理………………………… ……………………………… ………………… …………… 3 5 .材料和设备 ……………………………………… ………… ………………………… …… 4 6.试验方法 ………………………………………………………………………………… … 4 2 前 言 本标准按照 GB/T1.1-2009给出规则起草。 本标准由上海日用 化学品行业协会提出和归口。 本标准起草单位： 上海出入境检验检疫动植物与食品检验检疫技术中心、 上海家化联合股份有限公 司、伽蓝（集团）股份有限公司、 上海相宜本草化妆品股份有限公司 、上海中翊日化有限公司 、上海市 质量监督检验技术研究院 、玫琳凯（中国） 有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海清轩生物 科技有限公司 有限公司、 汉高（中国）投资有限公司、 广东博溪生物科技有限公司、 东阿阿胶股份有限 公司、上海日用化学品行业协会 。 本标准主要起草人： 卞俐娜、丁诗璇、张丽婷 、陈田、吴建铭、吕智、 孙培文、 林艺青、 戴彦韵、 万向红、李 琼、高宏旗 、金坚、陈亦华 3 化妆品眼刺激性 /腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验 1 范围 本标准规定了化妆品（及原料）眼刺激性鸡胚绒毛尿囊膜试验测试方法。 本标准可用于产品配方的筛选。 本标准可作为化妆品眼刺激性体外试验方法。 本标准可作为眼刺激性评估体外组合方法之一。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 2285 化妆品体外替代试验实验室规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 眼刺激性 eye irritation 眼球表面直接接触受试物后引起的眼及周围粘膜可逆性炎性变化。 3.2 眼腐蚀性 eye corrosion 眼球表面直接接触受试物后引起的眼及周围粘膜不可逆性组织损伤。 3.3 绒毛尿囊膜 chorioallantoic membrane, CAM 胚龄 4d~5d时，由绒毛膜体壁中胚层和尿囊膜脏层中胚层融合而成，其组织学结构有三层。 3.4 出血 hemorrhage 血液从 CAM膜血管内流出血管外，可以表现为血管外出现点状出血或 絮状的弥漫性出血等多种 形式。 3.5 凝血 coagulation 血管内、外蛋白的变性，表现为血管内血流变慢或血栓形成，血管呈现棕黑色，血管外出现浑浊 和不透明。 3.6 刺激分数 Effective Score （ES） 产生不同程度出血、凝血和血管融解刺激反应的分值。 3.7 血管融解 blood vessel lysis CAM膜上小血管壁破裂，血管融解消失。 4 原理 绒毛尿囊膜（ CAM）是一个呼吸性膜，包围在鸡胚周围。由于鸡胚尿囊膜表面血管丰富，可以看作 一个完整的生物体，本试验利用孵化的鸡胚中期绒毛尿囊膜血管系统完整、清晰和透明的特点，将一定4 量受试物直接与鸡胚尿囊膜接触，作用规定时间之后观察绒毛尿囊膜毒性效应指标（如：出血、凝血和 血管融解）的变化，给予评分，计算数学平均值用于评估受试物的眼刺激性。 5 材料与设备 5.1 体视显微镜（最好带 CCD摄像头） 5.2 照蛋器 5.3 孵蛋箱 5.4 电子计时器 5.5 微量加样器及一次性枪头 5.6 无菌生理盐水 5.7 牙科弯头镊 6 试验方法 6.1 基本要求 试验环境和操作需符合 SN/T 2285 规范要求。 试验鸡胚保持于孵蛋箱中， 使用时再个别取出。 在规定的暴露时间终止后立刻拍照， 迅速观察出血、 凝血和血管融解的毒性效应程度，给予评分。由于是主观判断，试验人员必须接受培训和监督考评。 6.2 试验准备 6.2.1 鸡胚品系 白莱杭鸡（ White Leghorn chicken ）等品种的受精鸡胚，鸡胚重量 50g-60g，优先选用 SPF鸡胚，鸡 胚质量符合相关标准的要求。 6.2.2 孵化条件 孵化温度 37.5 ℃± 0.5 ℃，相对湿度 55%-70%，翻蛋频率 3次/h-6次/h。 6.2.3 鸡胚准备 孵化至第 8日用照蛋器照蛋检查，弃未受精、无活性的鸡胚，选取血管发育良好的鸡胚，在蛋壳表 面标记气室位置。 6.2.4 受试物制备 不论样品性状如何，产品可以使用原样或者目标浓度进行试验。如果为液体，取 0.3 mL作用于 CAM。如果为固体，先研磨成细粉末或者削成薄片，再用少量双蒸水湿润称取 0.3g后作用于 CAM。如 样品为膏状物，可将受试物涂布于塑料薄膜表面，翻转薄膜，将样品面与 CAM接触。 注：着色力强的有色样本或者粘性非常强的样本不适合本方法。也可以先进行稀释，然后再进行 试验。 6.2.5 阴性对照 通常选用 0.9%的氯化钠溶液。 6.2.6 阳性对照 5 阳性对照应当是能够产生严重反应的物质，如 1%SDS、0.1mol/L 氢氧化钠。 7 正式试验 7.1 试验分组 每组至少 6只鸡胚，每一次试验都需要设置阴性对照和阳性对照。 7.2 暴露 第9日开始试验。用牙科弯镊小心剥去气室蛋壳部分，在蛋壳膜表面滴几滴生理盐水使充分润湿， 倾出后，用镊子小心除去蛋壳膜，保证暴露的尿囊膜完整不受任何损伤。 取0.3ml/0.3g 受试物直接作用 于CAM。尽量涂布开，确保覆盖面积达到至少 50%。作用 3min后，用双蒸 水轻轻冲洗 CAM表面，在 30s 内冲洗完成，倾出液体，立即在体视显微镜下观察每种毒性效应变化程度，给予评分（ ES） 。条件允许， 应在 3min暴露完成后，观察开始时立即拍照。 7.3 结果观察 7.3.1 出血 血液从 CAM的血管或毛细血管流出。根据无出血、轻度出血、中度出血、重度出血分别判予 0、 1、2、3分。 7.3.2 凝血 指血管内外蛋白变性，表现为血栓、管壁肿胀、血管内外的凝血点出现、血管外乳浊状浑浊等状 况。根据无凝血、轻度凝血、中度凝血、重度凝血分别判予 0、1、2、3分。 7.3.3 血管融解 指CAM膜上血管消融。根据无血管融解、轻度血管融解、中度血管融解、重度血管融解分别判 予0、1、2、3分。 7.4 结果计算和评价 按以下公式计算 ES平均分值，按表 1判断刺激分类。 表1 结果评价 终点评分 刺激性分类 ES≤12 无/轻刺激性 12<ES<16 中度刺激性 ES≥16 严重刺激性 _________________________________