ICSICS 67.160.10 CCS X 62 团 体 标 准 T/ NAIA 084-2021 葡萄酒中羟基肉桂酸类物质含量的测定 高效液相色谱法 (征求意见稿) 2021-11-03发布 2021-11-10实施 宁夏化学分析测试协会 发 布 发布TB 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。 本文件起草单位 ：宁夏农产品质量标准与检测技术研究所、宁夏农林科学院、西北农林科技大 学、宁夏化学分析测试协会。 本文件主要起草人：葛谦、吴燕、李彩虹、王劲松、马婷婷、张锋锋、牛艳、孙翔宇、苏龙 、 赵丹青、张伟、赵子丹、张艳、王晓菁、张小飞。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 葡萄酒中羟基肉桂酸类物质含量的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件规定了葡萄酒中羟基肉桂酸类 物质含量的高效液相色谱测定方法。 本文件适用于葡萄酒中羟基肉桂酸类物质：香豆酸、反式 -单阿魏酰酒石酸酯、咖啡酸、对香 豆酸、4-羟基肉桂酸、阿魏酸、 3-羟基肉桂酸、芥子酸、异阿魏酸含量的测定。 本文件的方法检出限 ：香豆酸、 4-羟基肉桂酸 的检出限均为 0.0450 mg/L，反式-单阿魏酰酒石 酸酯、咖啡酸的 检出限均为 0.0384 mg/L，对香豆酸、阿魏酸 的检出限均为 0.0320 mg/L，3-羟基肉 桂酸、芥子酸、异阿魏酸 的检出限均为 0.0282 mg/L。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单 ） 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 本文件没有 需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中的羟基肉桂酸类物质用乙酸乙酯溶剂萃取 ，浓缩至干 ，甲醇定容 ，微孔滤膜过滤 ，高效 液相色谱法测定，外标法定量。 5 试剂与材料 除非另有说明，本方法所使用试剂均为分析纯。 本方法所用水为 GB/T 6682中规定的一级水。 5.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 5.2 乙酸（CH3COOH）：优级纯。 5.3 乙酸乙酯（ C4H8O2）：色谱纯。 5.4 香豆酸（ Coumalic Acid，CAS号500-05-0 ，纯度≥ 98.7%）、反式 -单阿魏酰酒石酸酯 （trans-Fertaric acid，CAS号74282-22-7 ，纯度≥ 96.35%）、咖啡酸（ Caffeic acid，CAS号 331-39-5 ，纯度≥98%）、对香豆酸（ p-Coumaric acid，CAS号501-98-4 ，纯度≥ 98%）、4-羟基肉 桂酸（4-Hydroxycinnamic acid，CAS号4501-31-9 ，纯度≥97%）、3-羟基肉桂酸 （3-Hydroxycinnamic acid，CAS号14755-02-3 ，纯度≥ 96.5%）、阿魏酸（ Ferulic acid，CAS号1135-24-6 ，纯度≥ 99%）、芥子酸（ Sinapic acid，CAS号530-59-6 ，纯度≥ 99%）、异阿魏酸（ trans-Fertaric acid，CAS号25522-33-2 ，纯度≥ 95%）。 5.5 80 %甲醇溶液： 量取80 mL甲醇，用水定容至 100 mL。 5.6 20 %甲醇溶液： 量取20 mL甲醇，用水定容至 100 mL。 全国团体标准信息平台 5.7 羟基肉桂酸类物质单标储备溶液 分别准确称取 100 mg（精准到0.1 mg）香豆酸（ Coumalic Acid）、反式 -单阿魏酰酒石酸酯 （trans-Fertaric acid）、咖啡酸（ Caffeic acid）、对香豆酸（ p-Coumaric acid）、4-羟基肉 桂酸（4-Hydroxycinnamic acid）、3-羟基肉桂酸（ 3-Hydroxycinnamic acid）、阿魏酸（ Ferulic acid）、芥子酸（ Sinapic acid）、异阿魏酸（ trans-Fertaric acid），用80 %甲醇溶液（ 5.5） 溶解并分别定容至 10 mL容量瓶中， 配置成质量浓度为 10 mg/mL的单标储备液，于 -20 ℃下，贮存 于密闭的棕色玻璃瓶中。 5.8 羟基肉桂酸类物质混合标准使用液 以80 %甲醇溶液（ 5.5）作为溶剂， 将9种羟基肉桂酸类物质单标储备液 稀释配制成 2.0 mg/mL 混合标准使用液。 5.9 0.45μm滤膜，有机相。 6 仪器与设备 6.1 高效液相色谱仪（配紫外检测器） 。 6.2 旋转蒸发仪。 6.3 分析天平：感量为 0.01mg。 6.4 超纯水机。 7 试样的提取 准确吸取 5 mL葡萄酒样品于 50 mL试管中，加入 20 mL乙酸乙酯，转移至分液漏斗中，静置分层 后分液，收集上层有机相，下层水相再次置于分液漏斗中萃取，重复上述操作 3次。合并有机相并 转入蒸馏瓶中，经旋转蒸发仪蒸发至干。残渣溶于 2.5 mL20 %甲醇水溶液（ 5.6）中，经滤膜 (5.9) 过滤，上机待测。 8 测定 8.1 液相色谱参考条件 色谱柱： Agilent-ZORBAX SB-C18 色谱柱 （4.6mm×250mm，5μm ）或性能相当者。 流动相： A为2 %乙酸水； B为5 %乙酸-50 %乙腈水溶液；梯度洗脱，条件见表 1。 柱温：40 ℃。 检测波长： 320 nm。 进样体积： 10 μL。 流速：0.8 mL/min。 表1 流动相梯度洗脱条件 时间/min 流动相A/% 流动相B/% 0 90 10 5 88 12 全国团体标准信息平台 15 87 13 18 84 16 21 80 20 26 70 30 36 55 45 38 90 10 43 90 10 8.2 标准曲线的绘制 取羟基肉桂酸类物质混合标准使用液（ 5.8）适量，以 80%甲醇溶液为溶剂， 分别将其稀释成 0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0mg/mL的系列标准 溶液，按8.1进行测定 （色谱图参见附录 A）。以标准溶液质量浓度 （x）为横坐标 ，相应的峰面积 （y）为纵坐标，计算标准曲线或求线性回归方程。 8.3 试样的测定 做两份试样平行测定。 取10 μL试样溶液和相应的标准工作溶液顺序进样，以保留时间定性 ， 以色谱峰面积积分值定量 ，依据标准曲线回归方程计算试样中 9种羟基肉桂酸类物质的浓度 。响应 值应在标准曲线范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。 8.4 空白试验 除不加试样外，均按上述步骤进行操作。 9 结果计算和表达 试样中香豆酸、反式 -单阿魏酰酒石酸酯、咖啡酸、对香豆酸、 4-羟基肉桂酸、阿魏酸、 3-羟 基肉桂酸、芥子酸、异阿魏酸的 含量以质量分数 ω计，数值以毫克每 升（mg/L）计，按式⑴计算 ： ………………………… （1） 式中： ρ —— 标准曲线计算出样液中 香豆酸、反式 -单阿魏酰酒石酸酯、咖啡酸、对香豆酸、 4-羟基 肉桂酸、阿魏酸、 3-羟基肉桂酸、芥子酸、异阿魏酸 的质量浓度，单位为（ mg/L）； V1 —— 样品溶液 最终定容体积，单位为毫升（ mL）； V —— 所取试样的质量，单位为 毫升（ml）； 测定结果保留三位有效数字。 10 精密度 在重复性条件下， 获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的 10%。 VV1 全国团体标准信息平台 附 录 A （资料性） 9种羟基肉桂酸类单体酚混合标准溶液色谱图 9种羟基肉桂酸类单体酚混合标准溶液色谱图， 见图A.1。 标引序号说明： 1——香豆酸； 2——反式-单阿魏酰酒石酸酯； 3——咖啡酸； 4——对香豆酸； 5——4-羟基肉桂酸； 6——阿魏酸； 7——3-羟基肉桂酸； 8——芥子酸； 9——异阿魏酸。 图A.1 9种羟基肉桂酸类单体酚混合标准溶液色谱图 全国团体标准信息平台