ICS 07.100 C 01 团体标准 T/CPMA 010—2020 基于高通量测序的病原体筛查通用准则 General criteria for pathogen screening based on high-throughput sequencing 2020-07-01发布 2020-10-01实施 中华预防医学会 发 布 全国团体标准信息平台 T/CPMA 010-2020 I 目 次 前言 ................................................................................ Ⅱ 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 试验方法 .......................................................................... 3 5 技术指标 .......................................................................... 4 附录A（规范性附录） 实验室功能分区 .................................................. 6 全国团体标准信息平台 T/CPMA 010-2020 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1一 2009给出的规则起草。 本标准由中华预防医学会归口。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、北京化工大学和中国医学科学院病原 生物学研究所。 本标准主要起草人： 张雯、童贻刚、任丽丽、韩娜、肖艳、安小平 、王媛媛 。 全国团体标准信息平台 T/CPMA 010-2020 1 基于高通量测序的病原体筛查通用准则 1 范围 本标准适用于呼吸道样本（鼻/ 咽拭子、鼻咽吸取物、痰液、肺泡灌洗液等） 、消化道样本（粪便、 肛拭子等） 、活检组织、生物体液样本（脑脊液、血液、胸腹水等） 、虫媒样本、环境样本 等类型样本 的病原体高通量测序筛查。 本标准适用于开展基于高通量测序的病原体筛查的实验室。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 CNAS -CL01 -A024:2018 检测和校准实验室能力认可准则在基因扩增检测领域的应用说明 GB/T 30989- 2014 高通量基因测序技术规程 GB/T 33681.1- 2017 高通量测序样本预处理方法 GB/T 35537- 2017 高通量基因测序结果评价要求 GB/T 35890- 2018 高通量测序数据序列格式规范 SN/T 1193- 2003 基因检验实验室技术要求 WSS 233 -2017 病原微生物实验室生物安全通用准则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 文库 library 由两端连有已有的特定序列，中间为未知序列的核酸片段组成的核酸分子的集合。 3.2 高通量测序 high -throughput sequencing 以一次并行几十万到几十亿条甚至更多核酸分子序列测定为标志， 适用于 DNA或RNA的测序技术。 3.3 病原体 pathogens 指致人类或动植物感染性疾病的生物总称，包括细菌、病毒、 寄生虫、 真菌等微生物或其他生物体。 全国团体标准信息平台 T/CPMA 010-2020 2 3.4 筛查 screenin g 通过某种方法手段对导致人群疾病的可能的因素进行查找。 3.5 核酸序列数据库 nucleotide database 按照数据结构来组织、存储和管理 DNA/RNA 核酸序列的数据仓库。 3.6 靶向测序 targeted sequencing 检测特定基因集或基因组区域内已知 和新型变异的测序方法。 3.7 鸟枪法测序 shotgun sequencing 也被称为随机测序，指随机将 DNA分解成小片段，并将小片段进行测序获得序列片段的方法。 3.8 读序 reads 高通量测序平台产生的碱基和质量值组成的字符串。 3.9 序列格式 sequence format 基于文本的、存储核酸序列和其测序质量信息的标准格式。 3.10 碱基质量值 base quality score 测序质量值是用于评价碱基测序准确度的指标。 3.11 测序读长 read length 测序能得到的片段的长度，通常以碱基数表示。 3.12 测序覆盖度 coverage rate 待测样本检出的病原体核苷酸序列检测结果覆盖于对应病原体参考全长基因组（属 /种水平）的比 例(测序覆盖度 =覆盖区域长度/ 参考序列总长度 )。 全国团体标准信息平台 T/CPMA 010-2020 3 3.13 测序深度 depth of sequencing 待测样本中 单个碱基 被检测的平均 次数。 4 试验方法 4.1 样本采集 样本采集后需 2小时内放置于 4 ℃冰箱中，在采集后 24小时内将容器运回实验室。如无法立即提取 核酸，需放置于- 80 ℃冰箱保存，不能反复冻融。 4.2 核酸提取 核酸提取前对样本采取物理破碎（如匀浆、液氮研磨、超声波破碎仪）的方式处理，以提高病原体 的核酸提取效率。核酸提取操作需符合试剂盒说明书的要求，提取后需质控。 4.3 文库构建 4.3.1 DNA建库 4.3.1.1 靶向测序 针对16S、ITS等特异序列，采用带标签的引物进行特异性 PCR扩增、纯化产物进行混合文库构建， 或者直接采用商品化试剂盒进行文库构建。 a）适用范围：核酸 浓度较低的样本，或仅需要进行初步种属鉴定的样本。 b）注意事项： 1) 采用高保真扩增酶； 2) 对于多可变区目标基因， 扩增跨区 靶序列（如 16S的V3-V4区）； 3) 采用公认的扩增引物 和长测序读长。 4.3.1.2 鸟枪法测序 针对样本中所有的 DNA，采取直接将 DNA打断后进行文库构建的方法。 a）适用范围：需要进行菌种鉴定且遗传信息分析（如功能基因）的样本。 b）注意事项： 1) 根据 DNA起始量大小选择相应的建库试剂盒：起始总 DNA量在 10ng以上采用普通建库 试剂盒；如总量在 100pg- 10ng之间，采用超微量 DNA建库试剂盒；如果 DNA量低于下 限，先进行全基因组扩增后，继续建库及测序步骤。 2) 根据采用的测序平台确定片段化长度； 3) 长测序读长（ >100bp）和双端测序对于结果判读有帮助，但所需时间更长。 4) 必要时建库前先去除宿主 DNA。 4.3.2 RNA建库 a）适用范围：不同浓度范围 的RNA样本；需要进行转录组学研究或 RNA病毒检测的样本。 b）注意事项： 全国团体标准信息平台 T/CPMA 010-2020 4 1) RNA逆转录前需冰上操作，防止 RNA降解； 2) 注意添加 RNA酶抑制剂； 3) 必要时建库前先去除核糖体 RNA。 4.4 测序及测序数据分析 利用高通量测序仪对构建的文库开展测序实验，并基于参比数据库开展分析，形成报告。操作需符 合测序仪生产企业的要求。 5 技术指标 5.1 实验室功能分区/实验室工作条件要求 5.1.1 实验室功能分区 实验室设9个或更多的功能区，即样本前处理区、试剂存储和准备区、样本制备区（核酸提取）、 核酸扩增区（第一扩增区）、建库区、文库扩增区（第二扩增区）、文库检测与质控区、测序工作区、 数据存贮与分析区。 各功能分区的工作条件、注意事项和仪器配备 参照附录 A。 5.1.2 实验室生物安全要求 实验室的设施、环境要求和生物安全管理必须符合 WSS 233 -2017中的规定。 实验室开展工作必须依据国家发布的病原微生物分类名录，完成风险评估，确定实验室人员防护、 标本运输等方面的防护水平。 5.1.3 实验室工作条件 各区域设有明确的标识 （包括生物安全标识） ，避免生物安全风险和 不同工作区域内的设备、物品 混用。样本 在工作区内单向流动。区分人流物流通道，保持各区 之间的空气压差 ，避免发生交叉污染。 5.2 质控品 样本处理和后续试验过程中均需平行设置阳性质控品和阴性质控品。 5.3 核酸质量控制要求 5.3.1 DNA质量控制要求 高质量的