Ｉ ＣＳ　 ６５． １２０ ＤＢ１３ Ｂ　４６ 河　　　　 北　　　　 省　　　　 地　　　　 方　　　　 标 准 ＤＢ１３／Ｔ　 １０９１一 ２００９ 饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定 — 分光光度法 　　 ２００９－０６－１７发布 ２００９－０７－０２实施 河 北 省 质 量 技 术 ｒ （ ． ｆ ：督 局 　　 发布 ＤＢ１３／Ｔ 　 １０９１－ ２００９ ．山占 ． 月Ｉ ｉ ．．舀．目 舀 本标准由河北省畜牧兽 医局提 出。 本标准起草单位：河北省饲料产品质量监督检验站、石家庄市畜产品质量监测中心。 本标准主要起草人：武英利、王萍、左晓磊、王作艳、闻超、武利勇。 ＤＢ１３／ Ｔ　 １０９１－ ２００９ 饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定 — 分光光度法 　　　 　　　　　　　　　　 １ 范围 本标准规定了饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的单位定义和测定方法。 　　　　 本标准适用于饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定。 　　　　 ２ 规范性引用文件 下列文件通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日 　　　　 期的引用文件，其随后所有的修改 单（ 不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是 否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 ＧＢＩ Ｔ　 ６ ６ ８２ －２ ００ ８ 分析实验室用水规格和试验方法 　　　　 ３ 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 　　　　 ３． １ 　　　　 酸性蛋白酶活力单位 在４ ０＇ Ｃ， 　 ｐＨ３． ０条件下，１ 　　　　 　 ｍｉ ｎ水解酪素生成１ 　 ５ｇ酪氨酸所需的酶的量，规定为一个酶活力单位。 ４ 原理 蛋白酶水解酪素产生酪氨酸，在碱性条件下含有酚基的酪氨酸将福林试剂还原生成钥蓝与钨蓝， 　　　　 溶液的颜色与酶解产生的酪氨酸的量成正比，而生成的酪氨酸的量与酶的活力成正比，用分光光度计 测定其吸光度值，根据吸光度值计算其酶活力。 ５ 仪器和设备 ５． １ 分析天平：感量０ ． ０ ０ ０　 １ 　 ｇ ０ ５． ２ 研钵。 ５． ３ 容量瓶：５ ０　 ｍＬ， 　 １ ０ ０　 ｍＬ０ ５． ４ 电炉：温度可调。 ５． ５ 恒温水浴摇床：温控范围３ ０℃土 ０． ２ ９ ０－６ ０℃土 ０． ２９ Ｃ０ 　 ５． ６ 烧杯：２ ０ ０　 ｍＬ， 　 ２ ５ ０　 ｍＬｏ ５． ７ 砂芯玻璃滤器：孔径０． ４ ５　 ５ｍ０ 　 ５． ８ 酸度计：精确至０． ０１ ０ ５． ９ 秒表。 ５． １ ０ 移液器：精度 １ ０　 Ａｌ ． ５． １ １ 分光光度计。 ５． １２ 比色管 ：２５　 ｍＬ０ ６ 试剂 方法中所用试剂，除另有规定外均为分析纯试剂， 　　　　 所用水应符合ＧＢ／ Ｔ　 ６ ６ ８ ２－２ ００ ８三级以上用水 ＤＢ１３／ Ｔ　 １０９１－ ２００９ 要求。 ６． １ 浓盐酸。 ６． ２ 磷酸 （ ８ ５ ％） ． ６． ３ ６． ４ ６． ５ ６． ６ ６． ７ 钨酸钠 （Ｎａ ２ ＷＯ４ ． ２Ｈ２ Ｏ） ｏ 钥酸钠 （Ｎａ ２ Ｍｏ Ｏ４ ． ２Ｈ刃） 。 硫酸锉。 浓澳水 （ ９ ９％） ． 碳酸钠。 ６． ８ 三氯乙酸。 ６． ９ 乳酸 （８ ０％－９ ０ ％） ． ６． １０ 乳酸钠 （ ７ ０ ％） ． ６． １１ 酪素。 ６． １ ２　Ｌ一酪氨酸标准品 （ 含量大于９ ９． ０％） ０ ７ 溶液 ７． １ 福林试剂 于２　 ００ ０　 ｍ 　　　　 Ｌ磨口回流装置中加人钨酸钠 （Ｎａ ２ ＷＯ４ ． ２Ｈ２ Ｏ） 　 １ ０ ０　 ｇ，钥酸钠 （Ｎａ ２ Ｍｏ Ｏ４ ． ２ Ｈ２ ０） 　２ ５　 ｇ， 水７ ００　 ｍＬ， 　 ８ ５ ％磷酸５ ０　 ｍＬ、浓盐酸 １ ０ ０　 ｍＬ，小火沸腾回流 １ ０ｈ，取下回流冷却器，在通风橱中加人 硫酸铿 （ 　 Ｌｉ ２ Ｓ Ｏ ４） 　 ５ ０　 ｇ 、水５ ０　 ｍＬ和数滴浓澳水 （ ９ ９ ％） ，再微沸 １ ５　 ｍｉ ｎ，以除去多余的澳 （ 冷后仍有绿 色需再加澳水，再煮沸除去过量的澳），冷却，加水定容至 １ 　 ０ ０ ０　 ｍＬ。混匀，过滤。制得的试剂应呈 金黄色，贮存于棕色瓶内。 ７． ２ 福林工作溶液 取一份福林试剂与二份水混合， 　　　　 摇匀即为福林工作溶液。 ７． ３ 碳酸钠溶液，浓度０． ４　 ｍｏ ｌ ／ Ｌ 称取无水碳酸钠４ ２． ４　 ｇ，用水溶解并定容至１ 　　　　 　 ０ ０ ０　 ｍＬｏ ７． ４ 三级乙酸溶液，浓度０． ４　 ｍｏ 此 称取三氯乙酸“． ４　 ｇ，用水溶解并定容至 　　　　１ 　 ００ ０　 ｍＬｏ ７． ５ 盐酸溶液，浓度０． １ 　 ｍｏ ｌ 几 量取盐酸９　 ｍＬ，用水溶解并定容至１ 　　　　 ０ ０ ０　 ｍＬｏ ７． ６ 盐酸溶液，浓度 ，ｍｏ ｌ ／ Ｌ 量取盐酸９ ０ｍＬ，用水溶解并定容至 　　　　 １０ ００　 ｍＬｏ ７． ７ 乳酸缓冲溶液，ｐＨ　 ３ ． ０ 甲液　　 称取乳酸１ ０ ． ６　 ｇ ， 　　　　 加水溶解并定容至１ 　 ０ ０ ０　 ｍＬ ｏ 乙液　　 称取乳酸钠 １ ６　 ｇ，加水溶解并定容至１ 　 ０ ０ ０　 ｍＬｏ 　　　　 取甲液８ 　 ｍＬ、乙液１ 　 ｍＬ混合，加水９　 ｍＬ稀释，摇匀即为ｐ 　　　　 Ｈ　 ３ ． ０的乳酸缓冲溶液。 ７． ８ 酪素溶液，浓度１ ０叭 称取酪素ｌｇ置研钵中 （ 　　　　 精确至０． ００ ０　 ２　 ｇ），加浓乳酸２ －３滴湿润，研磨３　 ｍｉ ｎ，加入 １ ５　 ｍＬ乳酸 缓冲溶液，静置，将上清液转移至１ ００　 ｍＬ容量瓶中。残渣继续研磨至少３　 ｍｉ ｎ，加人 １ ０　 ｍＬ乳酸缓冲 溶液，静置，将上清液转移至容量瓶中，如此重复至少３次，将酪素全部转移至容量瓶中。在沸水浴 中加热至完全溶解， 冷却后用乳酸缓冲溶液定容至刻度。此溶液在冰箱内４９ Ｃ贮存，有效期为 ３　 ｄａ ７． ９ 卜酪氨酸工作溶液，浓度１ ００　 ５岁ｍＬ 称取预先于 １ ０ ５℃干燥至恒重的Ｌ－酪氨酸０ 　　　　 ． １ ０ ０　 ０　 ｇ（ 精确至０ ． ０ ０ ０　 ２　 ｇ），用 １ 　 ｍｏ ｌ ／ Ｌ的盐酸溶液 ６ ０　 ｍＬ溶解后定容至 １ ０ ０　 ｍＬ容量瓶中，即为１ 　 ｍｇ ／ 　 ｍＬ酪氨酸标准贮备溶液。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ＤＢ１３／Ｔ　 １０９１－ ２００９ 准确量取 ｌｍ创ｍＬ酪氨酸标准贮备溶液 １ ０． ０ ０　 ｍＬ置 １ ００　 ＭＬ容量瓶中，用０ ． １ 　 ｍｏ ｌ ／ Ｌ盐酸定容至刻 　　　　 度，即得到１ ０ ０　 ｐ　 ｇ ／ 　 ｍＬ　 Ｌ － 酪氨酸标准溶液。 ８ 试样的选取和制备 选取具有代表性的 　　　　 试样用四分法缩减至２ ０ ０　 ｇ ，粉碎至０ ． ２ ５　 ｍｍ，装人密封容器中，备用。 ９ 分析步骤 ９． ， 标准工作曲线的绘制 ９． １ ． １ 准确量取Ｌ－酪氨酸标准溶液０， 　１ ． ０， 　 ２ ． ０， 　 ３ ． ０， 　 ４． ０， 　 ５． ０　 ｍＬ，分别置于６只　 ２ ５　 ｍＬ比色管中， 加水定容至１ ０　 ｍＬ，即浓度为０， 　 １ ０， 　 ２ ０， 　 ３ ０， 　 ４ ０， 　 ５ ０　 ５ｇ ／ 　 ｍＬ的标准２作溶液。 ９． １． ２ 分别取 ９ ． １ ． １ 　 Ｌ－酪氨酸标准工作溶液 １ ． ０ ０　 ｍＬ置于另外 ６只２ ５　 ｍＬ比色管中，各加碳酸钠溶液 ５． ００　 ｍＬ，福林工作溶液１ ． ００　 ｍＬ，置４ ０℃士０ ． ２ ℃水浴中显色２ ０　 ｍｉ ｎ（ 准确计时），作为标准测试溶液 。 ９． １ ． ３ 以０浓度标准测试溶液为空白对照，在６ ８ ０　 ｎｍ波长处分别测定其吸光度。以吸光度Ａ为横坐 标，酪氨酸的量 Ｃ为纵坐标，计算出标准曲线回归方程。 ９． ２ 待测酶液的制备 ９． ２ ． １ 称取试样０ ． ５ －２ 　 ｇ（ 精确至０ ． ０ ０ ０　 ２　 ｇ ）置研钵中，用少量乳酸缓冲液湿润，研磨至少３ 　 ｍｉ ｎ， 加人 １ ５　 ｍＬ乳酸缓冲溶液混匀，静置，将上层清液转移至 １ ０ ０　 ｍＬ容量瓶中。 ９． ２． ２ 沉渣部分继续研磨至少 ３分钟，加人 １ ０　 ｍＬ乳酸缓冲溶液混匀，静置，将上层清液转移至容量 瓶中。重复上述操作至少３次，将试样全部转移人容量瓶中，用乳酸缓冲溶液定容至刻度，摇匀 （ 酶 活力应控制在８　 Ｕ／ ｍＬ＾ － １ ０　 Ｕ／ ｍＬ范围内）供试验用。 ９． ３ 测定 ９． ３． ， 样品空白测定溶液 ９． ３． １． １ 准确量取 ９． ２． ２测定溶液 （ 混悬溶液，摇匀后立即量取）Ｉ 　 ｍＬ于 ２５　 ｍＬ比色管中，置温度 ４ ０９ Ｃ１ ０． ２９ Ｃ、振摇速度 １ ００次／ 分钟的水浴摇床中预热２　 ｍｉ ｎ，加人２． ０ ０　 ｍＬ三抓乙酸溶液，摇匀，再置 上述水浴摇床中保温１ ０　 ｍｉ ｎ（ 准确计时） 。 ９． ３． １ ． ２ 取１ ． ００　 ｍＬ酪素溶液加人９． ３． １ １比色管中，摇匀，静置 １ ０　 ｍｉ ｎ，用定量滤纸过滤，滤液备用。 ９． ３． １． ３ 准确量取 ９ ． ３． １ ． ２滤液 １ ． ０ ０　 ｍＬ置于另一比色管中，加碳酸钠溶液５． ０ ０　 ｍＬ，加福林工作溶液 １ ． ０ ０　 ｍＬ，置温度４ ０＇ Ｃ１ ０． ２ ９ Ｃ、振摇速度 １ ０ ０次／ 分钟的水浴摇床中显色２ ０　 ｍｉ ｎ（ 准确计时）， 作为样品 空白测试溶液。 ９． ３． ２ 样品测定溶液 ９． ３． ２． １ 准确量取９． ２． ２试验溶液 （ 混悬溶液，摇匀后立即取样）１ｍＬ于２ ５　 ｍＬ比色管中，置温度 ４ ０ ℃土 ０． ２９ Ｃ、振摇速度 １ ０ ０次／ｍｉ ｎ的水浴摇床中预热２　 ｍｉ ｎ ，然后，加 １ ． ０ ０　 ｍＬ酪素溶液，摇匀，置上 述水浴摇床中保温 １ ０　 ｍｉ ｎ（ 准确计时） 。 ９． ３． ２． ２ 在９ ． ３． ２． １比色管中加人２． ０ ０　 ｍＬ三抓乙酸溶液， 摇匀，静置 １ ０　 ｍｉ ｎ，用定量滤纸过滤，滤液备 用。 ９． ３． ２． ３ 准确量取９． ３ ． ２． ２滤液 １ ． ０ ０　 ｍＬ，加碳酸钠溶液５． ０ ０　 ｍＬ，加福林工作溶液 １ ． ０ ０　 ｍＬ，置温度 ４ ０ ℃土 ０． ２ ９ ０、振摇速度 １ ０ ０次／ｍｉ ｎ的水浴摇床中显色２ ０　 ｍｉ ｎ（ 准确计时） ，作为样品测试溶液。 ９． ３．