Ｉ ＣＳ　 ６５． １２０ ＤＢ１３ Ｂ　４６ 河　　　　 北　　　　 省　　　　 地　　　　 方　　　　 标 准 ＤＢ１３／Ｔ　 １０９０－ ２００９ 饲料用酶制剂中木聚糖酶活力的测定 — 分光光度法 　　　 ２００９－０６－１ ７发布 ２００９－０７－０２实施 河 北 省 质 量 技 术 监 督 局 　　发 布 ＤＢ１３／Ｔ　 １０９０－ ２００９ 前 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ．占 ． 曰 　　　　　　　　　　　　 本标准由河北省畜牧兽医局提出。 本标准起草单位 ：河北省饲料产品质量监督检验站 、石家庄市畜产 品质量监测中心 、河北省畜牧 本标准主要起草人：武英利、王萍、左晓磊、闺超、王作艳、李广东。 ＤＢ　 １　 ３／Ｔ　 １０９０－ ２００９ 饲料用酶制剂中木聚糖酶活力的测定 分光光度法 １ 范围 本标准规定了饲料用酶制剂中木聚糖酶活力的单位定义和测定方法。 　　　　 本标准适用于饲料用酶制剂中木聚糖酶活力的测定，不适用于饲料中木聚糖酶活力的测定。 　　　　 ２ 规范性引用文件 下列文件通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日 　　　　 期的引用文件，其随后所有的修改 单（ 不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是 否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 ＧＢ／ Ｔ　 ６ ６８ ２ －２ ００ ８ 分析实验室用水规格和试验方法 　　　　 ３ 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 　　　　 ３． １ 　　　　 木聚糖酶活力单位 在５ ０ ０ Ｃ　 ， 　 ｐＨ５ ． ５的条件下，１ 　　　　　 ｍｉ ｎ水解木聚糖生成 １ 　 ５ｍｏ ｌ木糖所需的酶的量，规定为一个酶活力 单位 。 ４ 原理 木聚糖酶水解木聚糖生成木糖和木二糖等低聚糖， 　　　　 生成的木糖在沸水浴条件下还原３， 　 ５ 一二硝基水 杨酸，生成棕红色的３ －氨基一 ５一硝基水杨酸，溶液颜色与酶解产生的木糖量成正比，而木糖的生成量 与酶的活力成正比，用分光光度计测定其吸光度值，依据吸光度值计算其酶活力。 ５ 仪器和设备 ５． ， 分析天平：感量０ ． ００ ０　 １ 　 ｇ０ ５． ２ 研钵。 ５． ３ 容量瓶：５ ０　 ｍＬ， 　１ ０ ０　 ｍＬ０ ５． ４ 电炉：温度可调。 ５． ５ 恒温水浴摇床：温控范围３ ０℃土 ０． ２０ Ｃ＇ －－ ６ ０℃土 ０． ２０ Ｃ． ５． ６ 烧杯：２ ００　 ｍＬ， 　 ２５ ０　 ｍＬ０ ５． ７ 砂芯玻璃滤器：孔径０． ４ ５　 ５ｍ０ ５． ８ 酸度计：精确至 ０． ０１ ０ ５． ９ 秒表。 ５． １ ０ 离心机：６　 ００ ０　 ｒ ／ ｍｉ ｎ　 ０ ５． １ １ 移液器：精度 １ ０　 ５ｌ ０ ５． １ ２ 分光光度计。 ５． １３ 比色管 ：２５　 ｍＬ０ ６ 试剂 ＤＢ１３／ Ｔ　 １０９０－ ２００９ 方法中所用试剂， 　　　　 除另有规定外均为分析纯试剂，所用水应符合 ＧＢ／ Ｔ　 ６ ６８ ２ －２ ００ ８三级以上用水 要求。 ６． １ 氢氧化钠。 ６． ２ 冰乙酸。 ６． ３ 三水乙酸钠 （ ＣＨ３ ＣＯＯＮａ＂ 　 ３Ｈ２ 　 Ｏ） 　 ０ ６． ４　　 ３， 　 ５ 一二硝基水杨酸。 ６． ５ 四水酒石酸钾钠 （ Ｃ４ Ｈ刀６ ． ４Ｈ刃） 。 ６． ６ 苯酚。 ６． ７ 无水硫酸钠。 ６． ８ 木糖：含量大于 ９ ９ ％　 ０ ６． ９ 木聚糖。 ７ 溶液 ７． １ 氮氧化钠溶液，浓度２０ ０　 ｇ ／ Ｌ 称取２ ０． ０　 ｇ氢氧化钠，加水溶解， 　　　　 用水定容至１ ０ ０　 ｍＬ０ ７． ２ 乙酸溶液，浓度 ０． １ 　 ｍｏ 比 吸取冰乙酸０． ６ ０　 ｍＬ，加水溶解， 　　　　 用水定容至 １ ０ ０　 ｍＬ０ ７． ３ 乙酸钠溶液，浓度 ０． １ 　 ｍｏ 巩 称取三水乙醚钟１ ． ３ ６ 　 ｇ ，加水溶 　　 解， 用水定容至‘ Ｏ Ｏ 　 ｍ Ｌ ０ ７． ４ 乙酸一乙酸钠缓冲液，ｐ Ｈ５． ５ 称取三水乙酸钠２ ３． １ ４　 ｇ，加冰乙酸 　　　　 １ ． ７ ０　 ｍＬ用水溶解，并定容至２０ ００ｍＬ，用乙酸溶液或乙酸钠 溶液调　 ｐ Ｈ值至５ ． ５ｏ ７． ５　　　 ＤＮＳ试剂 （ ３， 　 ５ 一二硝基水杨酸试剂） 称取３， 　５ 一二硝基水杨酸 ３ ． １ ５　 ｇ，溶解于５ 　　　　 ０ ０　 ｍＬ水中，搅拌５ｓ，水浴加热至４ ５ ９ ０。缓缓加人 １ ０ ０　 ｍＬ氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液澄清 （ 此过程温度不要超过４８ － Ｃ） 。再依次加人四水 酒石酸钾钠９１ ． ０　 ｇ，苯酚２． ５ ０　 ｇ，无水硫酸钠２． ５ ０　 ｇ ，继续４ ５℃水浴保温，同时补加水３ ０ ０　 ｍＬ，搅拌至 完全溶解。冷却至室温后，用水定容至 １ 　 ０ ００　 ｍＬ，用砂心滤器过滤，滤液储存于棕色瓶中，室温下保 存７ｄ后使用，有效期６个月。 ７． ６ 木糖标准溶液，浓度１ ０ ０　 ５ｍｏ Ｖ ｍＬ 精密称取木糖１ ． ５ ０１ 　 ３　 ｇ，加乙酸一乙酸钠缓冲溶液溶解，定容至 　　　　 １ ００　 ｍＬ，摇匀即为 １ ００　 ５ｍｏ ｌ ／ ｍＬ 的木糖标准溶液。 ７， ７ 木聚糖溶液，浓度８． ０叭 称取木聚糖０ ． ８ ０　 ｇ于１ ０ ０　 ｍ 　　　　 Ｌ烧杯中，加人６ ０　 ｍＬ乙酸一 乙酸钠缓冲溶液，置磁力搅拌器上搅拌并 缓慢加热，直至完全溶解，然后停止加热，再搅拌３ ０　 ｍｉ ｎ，用乙酸一乙酸钠缓冲溶液转移并定容至１ ０ ０　 ｍＬ， 摇匀。４℃避光保存，有效期３　 ｄｏ ８ 试样的选取和制备 选取具有代表性的试样用四分法缩减至２ 　　　　 ００　 ｇ，粉碎至０． ２５　 ｍｍ，装人密封容器中，备用。 ９ 分析步骤 ９． １ 木糖标准工作曲线的绘制 ９． １ ． １ 准确量取 １ ０ ０　 ｕ ｍｏ ｌ ／ ｍＬ木糖标准液０， 　１ ． ０， 　 ２ ． ０， 　 ３ ． ０， 　 ４． ０， 　 ５． ０， 　 ６． ０　 ｍＬ置 ７支比色管中，分别 用乙酸一乙酸钠缓冲溶液定容至 １ ００　 ｍＬ，配制成０， 　 １ ． ０、２ ． ０、３ ． ０、４ ． ０、 　 ５ ． ０、６ ． ０　 ５ｍｏ ｌ ／ ｍＬ的标准 ＤＢ　 １３／ Ｔ　 １０９０－ ２００９ 工作溶液。 ９． １． ２ 准确量取 ９． １ ． １的标准工作溶液各 １ ． ０ ０　 ｍＬ，分别置 ７支比色管中，各加人乙酸一乙酸钠缓冲溶 液２ ． ０ ０　 ｍＬ和ＤＮＳ试剂２ ． ５　 ｍＬ，在沸水浴中显色３　 ｍｉ ｎ（ 准确计时），用水冷却至室温，加蒸馏水至刻 度，摇匀，作为标准测试溶液。 ９． １． ３ 以０浓度标准测试溶液为空白对照，在４８ ０　 ｎ ｍ处测定吸光度值。以木糖浓度为纵坐标 （ Ｙ轴）， 吸光度值为横坐标 （ Ｘ轴）计算出标准曲线回归方程。 ９． ２ 待测酶液的制备 ９ ． ２． １ 称取试样０． ５－２　 ｇ（ 精确至０． ０ ０ ０　 ２　 ｇ ）置研钵中， 用少量乙酸一乙酸钠缓冲溶液湿润，研磨 ３　 ｍｉ ｎ，加人 １ ５　 ｍＬ乙酸一乙酸钠缓冲溶液混匀，静置，将上层清液转移至 １ ０ ０　 ｍＬ容量瓶中。 ９． ２． ２ 沉渣部分继续研磨 ３　 ｍｉ ｎ，再用 １ ０　 ｍＬ乙酸一乙酸钠缓冲溶液混匀，静置，将上层清液转移至容 量瓶 中。 ９． ２． ３ 重复９． ２ ． ２操作至少３次，将试样全部转移至容量瓶中，用乙酸一乙酸钠缓冲溶液定容至刻度， 摇匀 。 ９． ２． ４ 取９． ２． ３溶液 ２ ０　 ｍＬ６　 ０ ０ ０　 ｒ ／ ｍｉ ｎ离心 １ ０　 ｍｉ ｎ，吸取上清液适量，用乙酸一乙酸钠缓冲溶液稀释至 酶活力 ０． ２　 Ｕ／ ｍＬ＾－ ０． ４　 Ｕ／ ｍＬ供试验用。 ９． ３ 测定 ９． ３． １ 样品空白测定溶液 ９． ３． １． ， 准确量取９ ． ２． ４稀释酶液１ ． ０ ０　 ｍＬ置于２５　 ｍＬ比色管中，置温度５ ０℃土 ０． ２ ９ ０、振摇速度 １ ０ ０次／ 分钟的水浴摇床中预热 １ ０　 ｍｉ ｎ，加入２ ． ５　 ｍＬ　 ＤＮＳ试剂，置沸水浴中加热３　 ｍｉ ｎ（ 准确计时），用水冷 却至约５ ０ ９ ０ ９． ３． １． ２ 加２ ． ００　 ｍＬ木聚糖溶液 （ 经过 ５ ０ ℃预热的）至 ９ ． ３． １ ． １比色管中，置温度 ５ ０℃士０ ． ２ ９ ０、振摇速度 １ ００次／ 分钟的水浴摇床中保温 １ ０　 ｍｉ ｎ（ 准确计时） 。用水冷却至室温，加蒸馏水至刻度 ，作为样品空白 测试溶液。 ９． ３． ２ 样品测定溶液 ９． ３． ２． １ 准确量取 ９． ２ ． ４的稀释酶液 １ ． ００　 ｍＬ于 ２ ５　 ｍＬ比色管中，置温度 ５ ０ Ｃ Ｃ１ ０． ２ ９ Ｃ、振摇速度 １ ０ ０次／ 分钟的水浴摇床中预热 １ ０　 ｍｉ ｎ，加人 ２ ． ０ ０　 ｍＬ木聚糖溶液 （ 经过５ ０℃预热的）， 置上述水浴摇床中保温 １ ０　 ｍｉ ｎ（ 准确计时），立即加人 ２． ５　 ｍＬ　 ＤＮＳ试剂终止反应。 ９． ３． ２． ２ 将９． ３． ２． １比色管置沸水浴中加热３　 ｍｉ ｎ（ 准确计时），用水冷却至室温，加蒸馏水至刻度，作 为样品测试溶液。 ９． ３． ２． ３ 以０浓度标准测试溶液为空白对照，在 ４８ ０　 ｎ ｍ波长处测定样品空白和样品测试溶液的吸收 度，用标准曲线回归方程计算出对应的木糖的量。 ９． ４ 结果计算和表述 ９． ４． １ 结果计算 木聚糖酶活力按 　　　　 （ １ ）式进行计算： Ｘ ＝ Ｗ ｘｎ ｌＯｘＭ 式 中： 　　　　　　 Ｘ－一一　　　　 酶活力单位，Ｕ／ ｇ ． ｗ— 用回归方程计算出的试样溶液相当的木糖量， 　　　　 ５ｍｏ ｌ ； 　 ｎ— １ ０　 － （Ｉ） 试样溶液总稀释倍数 ； 　　　　 酶反应时间 ，ｍｉ ｎ　 ； 　　　　 Ｍ— 试样质量，ｇ０ 　　　　 ９． ４． ２ 结果表述 每个样品应取 　　　　 ２份平行样进行测定，以其算术平均值为分析结果，结果保留整数。 ＤＢ１３／Ｔ 　 １０９０－ ２００９ １０ 孟复性 两平行测定结果 　　　　 的允许相对偏差不超过 ３． ０％．