ICS 11.220 B 41 备案号：36036-2013 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1745—2012 弓形虫聚合酶链式反应（PCR）检测方法 Detection method of polymerase chain reaction of Toxoplasma gondii 2012 - 12 - 21 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 01 - 01 实施 发 布 DB22/T 1745-2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。 本标准主要起草人：姚新华、苑淑贤、任科研、曹利利、杨金生、程荣华。 I DB22/T 1745-2012 弓形虫聚合酶链式反应（PCR）检测方法 1 范围 本标准规定了聚合酶链式反应（PCR）检测弓形虫的原理、实验材料、仪器设备、试剂、操作程序、 结果判定及废弃物处理和防止污染的措施。 本标准适用于PCR法检测弓形虫。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法。 3 原理 PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应， 通过变性、退火、延伸周期性的多次循环，使两个引物之间的特异性DNA片段得到体外扩增。出现1080bp 电泳条带为阳性，其它为阴性。 4 实验材料 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 眼科剪。 眼科镊。 称量纸。 一次性注射器 10 mL。 无菌离心管 1.5 mL。 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 薄壁 PCR 管 0.2 mL。 琼脂糖。 量筒 500 mL。 锥形瓶 500 mL。 吸头（10 μL、200 μL 、1000 μL）。 灭菌双蒸水。 5 仪器设备 5.1 分析天平。 5.2 PCR 扩增仪。 5.3 台式低温高速离心机。 1 DB22/T 1745-2012 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 6 试剂 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 6.11 7 电泳槽。 核酸电泳仪。 紫外凝胶成像仪或凝胶成像系统。 可调移液器（2 μL、20 μL、200 μL 、1000 μL）。 恒温水浴锅。 本标准所用试剂均为分析纯。 无菌双蒸水符合 GB/T 6682-1992。 溴化乙锭（EB）溶液 10 mg/mL：参见附录 A.1。 电泳缓冲液 50×TAE：参见附录 A.2。 1.5%琼脂糖凝胶：参见附录 A.3。 上样缓冲液：参见附录 A.4。 10×PCR 缓冲液：参见附录 A.5。 Taq DNA 聚合酶 2 u/µL。 dNTPs 2.5 mmol/L。 标准分子量 DL2000 DNA Marker。 引物与 PCR 扩增结果：参见附录 B1。 操作程序 7.1 样品处理 7.1.1 组织样品处理 取病死动物肝、脾、肺、淋巴结等组织10 g，磨碎后加生理盐水10 mL～20 mL制成乳剂，过滤，将 滤液3 000 r/min，离心10 min，弃去上清液，取沉淀物加生理盐水悬浮后，3 000 r/min，离心10 min，取 沉淀加入等体积虫体消化液（0.1 mol/L pH值8.0 Tris-HCl，1%SDS，0.1 mol/L NaCl，10 mol/L EDTA） 和蛋白酶K（20 mol/L），混匀后置于液氮5 min， 65 ℃水浴5 min，重复3 次操作后，65 ℃水浴2 h， 备用。 7.1.2 腹水样品处理 取患病或病死动物的腹水3.0 mL，加入等体积虫体消化液（0.1 mol/L pH值8.0 Tris-HCl，1%SDS， 0.1 mol/L NaCl，10 mol/L EDTA）和蛋白酶K（20 mol/L），混匀后置于液氮5 min， 65 ℃水浴5 min， 重复3次操作后，65 ℃水浴2 h，备用。 7.1.3 阳性对照处理 将虫体（RH株）用消化液（0.1 mol/L pH值8.0 Tris-HCl，1%SDS，0.1 mol/L NaCl，10 mol/L EDTA） 置于65℃水浴锅内裂解2 h，10000 r/min离心5 mim，吸上清，与等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25: 24: 1)混匀， 5 000 r/min离心10 min，取上清液，加等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25: 24: 1)抽提一次，颠倒混匀多次，常 温作用5 min，5000 r/min离心10 min，吸上清，加2倍体积无水乙醇，0.1倍体积3 mol/L NaAC于-20 ℃放 置30 min，10000 r/min离心10 min，取沉淀物加入无水乙醇700µL ，7000 r/min离心5 min，弃上清，自 然干燥30min-50min，用20 μL双蒸馏水溶解，-20 ℃保存。 2 DB22/T 1745-2012 7.1.4 阴性对照处理 用健康猪血清DNA作为标准阴性对照PCR模板。 7.2 PCR 扩增 备检样品PCR为50 μL体系： 10×PCR 缓冲液 dNTPs 5.0 ml 4.0 μL 见附录A.5 Taq DNA聚合酶 1.0 μL 上游引物 2.0 μL 见附录B.1 下游引物 2.0 μL 见附录B.2 备检样品 10.0 μL 灭菌双馏水加至50.0 μL。 同时设立标准阳性、阴性、空白（水）样品对照样品组，反应体系与备检样品组完全相同。 PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环； 72 ℃延伸7 min；4 ℃保持10 min。待检样品不能及时电泳时，-20 ℃保存。 7.3 电泳 7.3.1 7.3.2 7.3.3 7.3.4 7.3.5 7.3.6 7.3.7 7.3.8 8 制备 1.0%琼脂糖凝胶板（见附录 A.3）。 取 8 μL PCR 产物，与 2 μL 上样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。 同法加入阳性对照 PCR 产物。 同法加入阴性对照 PCR 产物。 同法加入空白对照 PCR 产物。 加入标准分子量 DL2000 DNA Marker。 5V/cm 电压，电泳 30 min。 用紫外凝胶成像仪或凝胶成像系统观察结果。 结果判定 当阳性对照出现1080 bp扩增带，阴性对照和空白对照未出现目的带时，实验结果成立：被检样品 出现1080 bp扩增带判为弓形虫阳性，未出现相应扩增带样品判为阴性。 9 废弃物处理和防止污染的措施 9.1 检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。 9.2 检测过程中防止交叉污染的有效措施是根据条件划分出核酸提取区、基因扩增区和电泳区。各区 所有的试剂、器材（尤其是移液器）、仪器都应专用，不得带出该区。 9.3 实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的 DNA。电泳后，琼脂糖凝胶及其它被溴化乙锭（EB） 污染的物品要有专用收集处，并进行焚烧处理。 3 DB22/T 1745-2012 AA 附 录 A （规范性附录） 相关试剂配制 A.1 溴化乙锭（EB）溶液 溴化乙锭 无菌蒸馏水 0.2 g 加至 20.0 mL A.2 电泳缓冲液制备 A.2.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液配制（pH8.0） 。 无水乙二铵四乙酸二钠 无菌蒸馏水 氢氧化钠（1 mol/L NaOH） 无菌蒸馏水 18.6g 80.0 mL 调 pH 值至 8.0 加至 100mL A.2.2 50×TAE电泳缓冲液配制 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 冰乙酸 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 值 8.0） 无菌蒸馏水 作电泳液使用时，用无菌蒸馏水 50 倍稀释。 242.0 g 57.1 mL 100 .0 mL 加至 1 000 mL A.3 1.0%琼脂糖凝胶板制备 琼脂糖 50×TAE 电泳缓冲液 无菌蒸馏水 1.0 g 2.0 mL 98.0 mL 微波炉中完全融化，待冷却至 50~60℃时，加溴化乙锭（EB）溶液 5 μL，摇匀，倒入电泳板上， 凝固后取下梳子，备用。 A.4 上样缓冲液 溴酚蓝 0.2 g，加 10 mL 无菌蒸馏水过夜溶解。50 g 蔗糖加入 50 mL 无菌蒸馏水溶解后，移入已溶 解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至 100 mL。 A.5 10×PCR扩增缓冲液 4 DB22/T 1745-2012 1 mol/L Tris-HCl（pH值8.8） 1 mol/L KC1 Nonidet P40 1.5 mol/L MgCl2 无菌蒸馏水 10.0 mL 50.0mL 8.0 mL 1.0 mL 加至100 mL 5 DB22/T 1745-2012 BB 附 录 B （规范性附录） 引物 B.1 上游引物 P1： 5`-AAT AAG CTT ATG CGA GGC GGG ACG TCC-3` B.2 下游引物 P2： 5`-ATA GCT GAC TCA CTG CTT AAT TTT CTC-3` B.3 引物浓度 引物浓度均为15 pmol/μL。 B.4 标准阳性PCR扩增结果 扩增结果见图B1。 1 2 ←1080bp 1: 标准分子量 DL2000 DNA Marker 2:MIC3 基因片段 图B.1 扩增结果 _________________________________ 6