ICS 65.120 B 04 备案号：35744-2013 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1613—2012 饲料中三聚氰胺含量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of melamine residues in feeds—— HPLC-MS/MS method 2012 - 12 - 01 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 01 - 01 实施 发 布 DB22/T 1613—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心、大成集团、嘉吉生化玉米工业有限公 司、白城出入境检验检疫局、珲春出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：胡婷婷、姚天玲、王晓红、张丽、冯博、刘伟艳、张琦、李玲。 I DB22/T 1613—2012 饲料中三聚氰胺含量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中三聚氰胺的液相色谱-质谱/质谱测定方法。 本标准适用于饲料及饲料原料中三聚氰胺的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 原理 试样中残留的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，用液相色谱质谱/质谱仪测定，外标法定量。 4 试剂与材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 三氯乙酸（C2 HCl 3 O 2 ）：优级纯。 4.2 乙酸铵（CH 3 COONH 4 ）：优级纯。 4.3 乙酸铅（C4H6O4 Pb.H2O）。 4.4 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 4.5 乙腈（CH3CN）：色谱纯。 4.6 氨水（NH 4OH）。 4.7 甲酸（CH 2O 2）：优级纯。 4.8 1%三氯乙酸溶液：准确称取 10 g 三氯乙酸（4.1）于 1 L 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混 匀后备用。 4.9 30%乙酸铅溶液：称取 60 g 乙酸铅（4.3） ，用 140 mL 水溶解，混匀。 4.10 5%氨化甲醇溶液：准确量取 5 mL 氨水（4.6）和 95 mL 甲醇，混匀后备用。 4.11 0.1%甲酸的水溶液：准确吸取 1 mL 甲酸（4.7） ，用水定容至 1 L，混合后备用。 4.12 10 mmol/L 乙酸铵溶液：准确称取 0.772 g 乙酸铵（4.2） ，用水溶解并定容至 1 L，混匀后备用。 1 DB22/T 1613—2012 4.13 标准储备溶液：准确称取三聚氰胺标准物质（CAS 号：108-78-1，含量≥99.0%）100 mg（精确 到 0.1 mg），用甲醇溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中，配制成浓度为 1000 µg/mL 的标准储备液。0 ℃~4 ℃可避光保存 6 个月。 4.14 标准工作液：准确移取一定体积的标准储备溶液（4.13），根据需要用基质液稀释成三聚氰胺浓 度为 0.5µg/mL、1.0µg/mL、2.0µg/mL、5.0µg/mL、10.0µg/mL、20.0µg/mL 和 50.0µg/mL 的系列标准工 作液。该溶液须配制于棕色容量瓶中，4-6℃条件下保存。 4.15 混合型阳离子交换固相萃取柱（MCX 固相萃取柱）：60 mg/3 mL。使用前依次用 3 mL 甲醇、3 mL 水活化。 4.16 5 滤膜：0.22 µm，有机系。 仪器 5.1 液相色谱-质谱/质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。 5.2 组织捣碎机。 5.3 高速离心机：10 000 r/min。 5.4 氮吹仪。 5.5 分析天平：感量为 0.01 g 和 0.0001 g。 5.6 超声波清洗器：40 kHz。 5.7 涡旋混合器。 6 分析步骤 6.1 提取 称取5 g（精确到0.01g）粉碎后的试样置于50 mL离心管中，加人25 mL三氯乙酸溶液（4.8），200 μL 乙酸铅溶液（4.9），涡旋混合1 min，超声提取10 min后，10 000 r/min离心5 min，取上清液2.5 mL 做待净化液。 6.2 净化 将6.1中的待净化液转移至活化后的MCX柱（4.15）中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后 用5 mL氨化甲醇溶液（4.10）洗脱，整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min。洗脱液于50 ℃下用氮气 吹至近干，残留物用1 mL甲醇定容，过0.22 mm滤膜后，供LC-MS/MS测定。 6.3 空白试验 除不称取试样外，均按6.1、6.2进行。 6.4 测定 6.4.1 色谱参考条件 色谱参考条件如下： a) 色谱柱：强阳离子交换与反相 C18 混合填料，混合比例（1：4），150 mm×2.0 mm，5μm； b) 流动相：10 mmol/L 乙酸铵-乙腈溶液（1+1），用乙酸调节至 pH=3.0 备用； 2 DB22/T 1613—2012 c) 流速：0.3 mL/min； d) 进样量：5 mL。 6.4.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下： a) 电离方式：电喷雾电离（ESI）； b) 扫描方式：正离子扫描，多反应监测（MRM）； c) 电离电压：3 kV～5 kV； d) 离子源温度：300 ℃～550 ℃； e) f) g) h) 脱溶剂气：0.75 MPa； 雾化气：1.5 MPa； 辅助气：1.5 MPa； 定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞能量见表 1。 表1 三聚氰胺监测离子对、去簇电压和碰撞能量 化合物名称 母离子 子离子 去簇电压 碰撞能量 m/z m/z V V 85* 55 27 68 55 40 127 三聚氰胺 注：加“*”的为定量离子。 6.4.3 定性分析 在同一色谱/质谱条件下进行标准溶液和样品溶液的测定，如果样品溶液中检出的色谱峰的保留时 间与标准物质色谱峰的保留时间一致，所选择的两对子离子的质荷比也一致，而且样品定性离子的相对 丰度与浓度相当标准工作溶液的定性离子的相对丰度相比较，相对标准偏差不超过表2规定的范围，则 可判定样品中存在该物质。标准溶液多反应监测色谱图参见附录A。 表2 定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50% ＞20%至50% ＞10%至20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 6.4.4 定量测定 根据试样中被测样液中被测组分的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行分析，对于高浓度 样品须适当进行系列稀释。标准工作液和样液中被测组分的响应值均应在仪器线性响应范围内。在上述 色谱条件下，三聚氰胺的参考保留时间为8.91min，外标法定量。标准溶液的多反应监测色谱图参见附 录A。 7 结果计算和表述 用色谱数据处理机或按公式（1）计算试样中三聚氰胺残留含量，计算结果需扣除空白值。 X = c ´V ……………………….………………… (1) m 式中： X —— 试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克 （mg/kg）； c —— 从标准曲线读出的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升（mg/mL） ； 3 DB22/T 1613—2012 V —— 样液最终定容体积，单位为毫升 （mL）； m ——样液所代表的最终试样的质量，单位为克 （g） ； 计算结果表示到小数点后一位。 8 定量限、回收率和精密度 8.1 定量限 本方法定量限为0.5 mg/kg。 8.2 回收率及精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定结果的算术平均值的15 %。 样品中三聚氰胺的添加浓度及其回收率、精密度实验数据参见附录B。 4 DB22/T 1613—2012 AA 附 录 A （资料性附录） 三聚氰胺标准品液相色谱-质谱/质谱图 图A.1 三聚氰胺标准品液相色谱-质谱/质谱图（0.5 mg/L） 5 DB22/T 1613—2012 BB 附 录 B （资料性附录） 不同添加水平平均回收率及精密度 B.1 三聚氰胺添加回收率和精密度（n=10） 添加浓度范围（0.5～5.0 mg/kg） 样品 饲料 回收率范围 相对标准偏差 % % 81.9～103.6 1.7～5.2 _________________________________ 6