ICS 11.220 B 41 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 1891—2013 活毒疫苗中禽白血病病毒污染检测 技术规程 Diagnostic Technology Specification on Avian Leukosis Virus Contamination of Live Attenuated Vaccine 2013 - 05 - 10 发布 安徽省质量技术监督局 2013 - 06 - 10 实施 发 布 DB34/T 1891—2013 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 鸡白血病是由反转录病毒科禽反转录病毒属的禽白血病病毒（ALV）引起的鸡的传染性肿瘤疾病， 以垂直传播为主，也可水平传播，是鸡的主要种源性免疫抑制病之一。近年来，鸡白血病的流行日趋严 重，活毒疫苗的污染是引起传播的重要因素，检测活毒疫苗中 ALV 的污染对防控鸡白血病具有重要意 义。 为了预防、控制和消灭鸡白血病，依据《中华人民共和国动物防疫法》及有关的法律法规，特制定 本规程。 本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：胡晓苗、张丹俊、侯宏艳、潘孝成、赵瑞宏、戴银、周学利、刘慧芳、沈学怀、 朱传民。 I DB34/T 1891—2013 活毒疫苗中禽白血病病毒污染检测 技术规程 1 范围 本标准规定了活毒疫苗中 ALV 污染的 ELASA 和 PCR 检测技术。 本标准适用于活毒疫苗中 ALV 污染的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 680-2003 禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法 中华人民共和国动物防疫法 3 弱毒疫苗的稀释方法 取 1000 羽份冻干苗 1 瓶，加 2 毫升灭菌生理盐水进行稀释，使 100 微升(0.1 毫升)中含疫苗 50 羽份。取 100 ul 稀释液进行 ELISA 检测，取 200 ul 稀释液提取 DNA，进行 PCR 检测。 4 检测方法 4.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测 按 NY/T 680-2003 的要求进行，试验成立条件略做修改，阳性对照 OD 均值减去阴性对照 OD 均 值改为大于 0.20 时试验成立，否则重做。 注：也可选择市售商品化 p27 抗原 ELISA 检测试剂盒，完成疫苗 p27 抗原的检测。 4.2 聚合酶链式反应（PCR）检测 4.2.1 材料 Taq 酶、dNTP、DNA Marker、琼脂糖、细胞裂解液、酚、氯仿、异戊醇、ddH2O、75％乙醇、特异 性引物、PCR 仪、高速台式冷冻离心机（最大转速 16000 rpm）、冰箱、水浴锅、微量移液器、电泳仪、 电泳槽、紫外凝胶成像仪。 4.2.2 操作方法 4.2.2.1 DNA 的提取 a) 阳性对照与样品同时提取 DNA，实验应使用灭菌超纯水作为阴性对照。取疫苗稀释液和细胞裂 解液各 200μL 加入 1.5 mL 离心管中，加蛋白酶 K10ul（2 mg/ml），颠倒混匀。 1 DB34/T 1891—2013 b) c) d) e) 在 65℃恒温水浴锅中水浴 30 min，也可在 37℃恒温箱中 1 h，间歇振荡数次。4℃，12000 rpm 离心 5 min，取上清入另一 EP 管中。 加入等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1),室温振荡 5 min，静置 5 min。4℃，12000 rpm 离 心 5 min，取上清入另一 EP 管中。可以抽提两次。 加两倍体积无水乙醇，放 -20℃冰箱 20 min。4℃，12000 rpm 离心 10 min。 倒掉上清液，加入 200 ul 70％乙醇，4℃，12000 rpm 离心 5 min。弃上清，干燥 15～20 分钟，让乙醇挥发干净。加入 20～30 ulTE，-20℃保存或直接 PCR。 注：也可选择市售商品化 DNA 提取试剂盒，完成 DNA 的提取。 4.2.2.2 PCR 反应体系 按表 1 给出的程序分步进行。 表1 PCR 反应体系配置表 试剂 体积/ul 10xbuffer 2 dDTP（2.5mM ） 2 上游引物 1 下游引物 1 Taq 酶 0.4 DNA 模版 2 ddH2O 11.6 注：根 据 禽 白 血 病 病 毒 各 亚 群 pol 基 因 序 列 相 对 保 守 的 特 点 ， 在 其 保 守 区 内 设 计 1 对 引 物 ： 上 游 5’-CTAACGAGGCGAGGGAATG-3’，下游 5’-TTGGTGGGTTGGGTGGAGA-3’，扩增长度 214 bp。 4.2.2.3 PCR 条件 按表 1 中加样顺序全部加完后，充分混匀，瞬时离心，使液体都沉降到 PCR 管底，按下列程序在 PCR 仪进行反应： 94℃ 5min 94℃ 30sec 58℃ 30sec 72℃ 40sec 72℃ 10min 32 个循环 4.2.2.4 电泳 称取 1 g 琼脂糖，加入 100 mL 1×电泳缓冲液。加热溶化后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中， 胶板厚 5 mm 左右。依据样品数选择合适的梳子。待凝胶凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内，加电 泳液直至淹没凝胶。取 6 μL～8 μL PCR 扩增产物与 1 μL～2 μL 加样缓冲液混匀后加入凝胶孔内， 2 DB34/T 1891—2013 在其中一孔内加入与样品相同体积的 DNA Marker，在电压 80 V～100 V 或在电流 40 mA～50 mA 电泳 30 min～40 min。 4.2.2.5 结果判定 电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射仪上打开紫外灯观察。阳性对照在 214 bp 处有明显的目的 条带，而阴性对照无任何条带则实验成立。若被检样品在 214 bp 处有明显条带，可判为阳性；否则为 阴性，见图 1。 M 1 2 3 4 5 6 bp 2000 1000 750 500 250 100 214 bp 图1 禽白血病病毒（ALV）P27抗原PCR阳性参考图 M：Marker；1: 阴性对照；2～6：阳性条带。 3 DB34/T 1891—2013 AA 附 录 A （规范性附录） PCR 试剂的配制 A.1 1M Tris溶液的配置 称取 Tris 242.2 g，加 ddH2O 至 1600 ml，加热溶解。 A.2 1M Tris-HCL Ph=8.0 溶液的配置 称取 1M Tris 溶液 160 ml 用分析纯盐酸调至 Ph=8.0（需浓盐酸约 8.5 ml），加 ddH2O 定容至 200 ml，高压灭菌备用。 A.3 10 MNaCL溶液的配制 称取 292.2 gNaCL，加入 500 ml 蒸馏水中，搅匀备用。 A.4 0.5 M EDTA溶液的配置 称取 EDTA-Na 237.2 g 先用 140 ml ddH2O 溶解，加入 14 ml NaOH（10 M）使 EDTA-Na2 溶解， 再用 NaOH（10 M）溶液调至 Ph=8.0，加 ddH2O 定容至 200 ml，高压灭菌备用。 A.5 10％SDS 溶液的配制 在 900 ml 蒸馏水中溶解 100 g SDS，加热至 68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的 pH 值至 7.2， 加水定容至 1 L，无须灭菌，分装备用。 A.6 细胞裂解液的配制 1M Tris-HCL 3 ml、10％SDS 1 ml、0.5 M EDTA 0.5 ml、 10 MNaCL 4 ml 加入 ddH2O，定容至 50 ml。 A.7 50×TAE 缓冲液（贮存液）配制 Tris 碱 242 g，冰醋酸 57.0 mL ，0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)100 mL 搅拌溶解后，用 NaOH 调 pH 至 8.3，加去离子水定容至 1000 mL，常温保持备用。 贮存液按 1：50 稀释后即为工作液。 A.8 1×TE缓冲溶液的配置 4 DB34/T 1891—2013 量取 1M Tris-HCl(pH 8.0)5 ml,0.5 M EDTA (pH 8.0)1 ml 于 500 ml 烧杯中,向烧杯中加入约 400 ml ddH2O 均匀混合,定容到 500 ml 后，高温高压灭菌,室温保存。 _________________________________ 5