ICS 11.220 B 41 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 1938—2013 鸭黄病毒感染诊断技术规程 Technical regulation for Diagnosis of duck flavivirus infection 2013 - 08 - 28 发布 安徽省质量技术监督局 2013 - 09 - 28 实施 发 布 DB34/T 1938—2013 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业委员会提出。 本标准起草单位：安徽农业大学动物科技学院、扬州大学兽医学院、安徽省动物疫病预防与控制中 心。 本标准主要起草人：王桂军、朱良强、耿照玉、魏建忠、占松鹤、潘玲、汪彤、何长生、江定丰、 杨德康、栗新、吴葆谊。 I DB34/T 1938—2013 鸭黄病毒感染诊断技术规程 1 范围 本标准规定了鸭黄病毒感染临床诊断和 PCR 检测的技术规程，其中包括流行病学、临床诊断、实 验室诊断以及试验材料、操作程序及结果判定。 本标准适用于临床鸭黄病毒感染的诊断和检测，PCR 检测适用于病鸭卵巢、输卵管、胰腺、脑等组 织的鸭黄病毒的检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 鸭黄病毒（duck flavivirus) 鸭黄病毒，又称鸭坦布苏病毒，属于黄病毒科。2010年以来，我国安徽、福建、山东、浙江、江苏 等地的蛋鸭和种鸭由于鸭黄病毒感染而引起产蛋量骤然减少，给我国养鸭业造成重大经济损失。 2.2 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR） PCR 技术是一种在体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法。由高温变性、低温退火及适温延伸等 几步反应组成一个周期，经过多次循环反应，使目的 DNA 得以大量扩增。 2.3 引物（primer） 根据鸭黄病毒 NS1 基因设计一对特异性引物： ——上游引物 R1：5'-CGCGGATCCTCTGGGAACGACGAGAAG-3' ——下游引物 R2：5'-CCGGAATTCTCGGCATTGACATTTACT-3' 3 仪器 PCR 仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、手提紫外线灯、紫外凝胶成像仪、微量移 液器、水浴箱等。 4 临床诊断 4.1 发病日龄 1 DB34/T 1938—2013 鸭黄病毒易感染通常发生于 25～40 周龄的产蛋种鸭、蛋鸭。 4.2 流行特点 该病一年四季均可发生。病鸭开始出现采食量减少和产蛋量下降。产蛋率从产蛋高峰下降到 10％ 以下，种蛋受精率降低 10％左右。病鸭产蛋多为畸形蛋和软壳蛋，病死率 0～15％。没有继发感染情 况下，病程持续 10～30 d，鸭群会自然康复，产蛋率也随之恢复，但一般最多可恢复到发病前的 70 ％。 4.3 临床症状 感染鸭黄病毒的鸭表现为发热、精神萎靡、站立不稳、共济失调、拉草绿色稀便、双腿瘫痪、向后 或侧面伸展。产蛋期间鸭感染鸭黄病毒表现产蛋下降，后备母鸭开产前感染鸭黄病毒可致开产推迟。人 工感染雏鸭最早可在 20 日龄左右发病，以神经症状为主，表现站立不稳、倒地不起、行走不稳，病鸭 有饮、食欲，但多数因饮水、采食困难衰竭而死，死淘率一般在 10％～30％。 4.4 剖检病变 剖检病死鸭，可见典型病理变化有：发病鸭解剖可见肝脏肿大，脂肪肝变性严重，表面有出血斑, 脾 脏肿大斑驳呈大理石样；胰腺有出血和坏死；卵泡变性、畸形、坏死或液化，卵泡膜充血、出血、萎缩 等症状。公鸭可见睾丸体积缩小，重量减轻，输精管萎缩。 5 RT-PCR 检测 5.1 采样 无菌采集上述临床诊断为鸭黄病毒感染疑似病鸭的卵巢、输卵管、胰腺和脑组织。 5.2 样品的处理 在 10℃以下进行样品处理。用无菌 PBS 缓冲液与样品按体积质量比 5:1 将样品研磨匀浆。将样 品匀浆放置于 -20℃中冷冻，再室温融解，反复三次。 5.3 RNA 抽提 在含有样品的塑料离心管中加入 600μL 抽提液 A（1 mol/L Tris 水溶液饱和酚:三氯甲烷:异戊 醇按照 25:24:1 的混合液），用力混合至少 30 s,12000r/min 离心 5 min,小心取上层水相(约 800 μ L) ， 再 加 入 700 μ L 抽 提 液 B( 三 氯 甲 烷 / 异 戊 醇 按 24:1 的 比 例 混 合 液 ) ， 用 力 混 合 至 少 30 s,12000r/min 离心 5 min，小心取上层水相(约 600μL)。再加入 -20℃预冷的 1.5 倍体积的无水乙 醉(约 900μL)，倒置数次混匀后。12000r/min 离心 30 min，小心弃去上清。干澡后加 10μL 水溶解， 用作模板。 5.4 变性和退火 在 PCR 管中加入 10μL 模板和 2.5μL 引物 R2，加 2.5μL 水使总体积为 15μL,置于 70℃反 应 5 min。立即冰浴 2 min，低速离心约 5 s。 5.5 cDNA 合成 2 DB34/T 1938—2013 在上述反应管中继续加入 5μL 的 5 倍逆转录酶浓缩缓冲液,2.5 mmol dNTPs 2μL ,O.5μL RNA 酶抑制剂(20 U),1μL 逆转录酶 M-MLV(10 U)和 1.5μL 水。37℃水浴 1 h，合成 cDNA 链。 完成后进行下一步反应。 5.6 PCR 扩增 DNA PCR 为 50μL 体系，包括： ——双蒸灭菌水 37.5μL ——反转录产物 4μL ——上游引物 0.5μL ——下游引物 0.5μL ——10×PCR Buffer 5μL ——2.5 mmol dNTPs 2μL ——Taq 酶 0.5μL 首先加入双蒸灭菌水，然后再按照顺序逐一加入上述成分，每一次要加入到液面以下。全部加完后， 混悬，瞬时离心，使液体都沉降到 PCR 管底。在每个 PCR 管中加入 1 滴液体石蜡（约 20 μL）。循 环参数为 95℃ 5 min,94℃ 30 s ,51℃ 30 s ,72℃ 45 s ，循环 30 次，72℃延伸 10 min。 5.7 电泳 5.7.1 5.7.2 5.7.3 5.7.4 5.7.5 5.7.6 制备 1.0％琼脂糖凝胶板 取 5μL PCR 产物，与 0.5μL 加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。 加入分子量标准。 盖好电泳仪，插好电极，将电压调至 90V 左右电泳，30～40 min。 在手提紫外线灯下观察；或者用紫外凝胶成像仪扫描图片存档，打印。 用分子量标准比较，判断 PCR 片段大小。 5.8 设立对照 5.8.1 从样品处理开始设立阳性对照、阴性对照和空白对照。 5.8.2 取含有鸭黄病毒 AH-F10 株（中国典型培养物保藏中心，保藏号 CCTCC V201213）的禽胚尿囊液 或细胞悬液为标准阳性对照。 5.8.3 取正常的阴性组织为模板作阴性对照。 5.8.4 取等体积水代替样品为模板作空白对照。 5.9 PCR 检测结果 5.9.1 在阳性对照出现相应大小扩增带、阴性对照及空白对照无此带出现的情况下判定结果； 5.9.2 结果出现大小约 260 bp 扩增片段时，初步判定为鸭黄病毒阳性； 5.9.3 未出现大小约 260 bp 扩增片段或片段大小与目的片段大小不符，判定为阴性。 6 结果判定 6.1 临床诊断符合 4.1、4.2、4.3、4.4，初步判定为鸭黄病毒感染疑似病例； 6.2 RT-PCR 检测结果符合 5.9.2，初步判定为鸭黄病毒感染疑似病例； 6.3 诊断结果符合 6.1、6.2，确诊为鸭黄病毒感染阳性。 _________________________________ 3