ICS 11.220 B 41 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 1940—2013 鸡传染性喉气管炎 PCR 检测技术规程 Technical regulation for detection of Chicken Infectious Laryngotracheitis by PCR 2013 - 08 - 28 发布 安徽省质量技术监督局 2013 - 09 - 28 实施 发 布 DB34/T 1940—2013 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业委员会提出。 本标准起草单位：安徽农业大学动物科技学院、安徽省动物疫病预防与控制中心。 本标准主要起草人: 王桂军、朱良强、耿照玉、占松鹤、汪彤、江定丰、魏建忠、潘玲、陈静、何 长生、杨德康、栗新、吴保谊。 I DB34/T 1940—2013 鸡传染性喉气管炎 PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了应用聚合酶链反应（PCR）方法检测鸡传染性喉气管炎，包括样品的采集、样品处理、 试验材料、操作程序和结果判定等。 本标准适用于临床鸡传染性喉气管炎的检测和诊断。 2 试验材料 2.1 特异性引物 根据 ILTV 的 TK 基因序列设计了一对引物，序列为：上游引物 A1： 5'- GGG AAA CTT GAA TGT CGG GAG-3', 下游引物 A2： 5'- TGG ATT ATA CGC CGT GCC TGT -3'，扩增 DNA 片段大小为 329 bp，引 物的使用浓度为 50 mmol/L。 2.2 试剂 2.2.1 DNA 提取试剂 DNA 提取试剂如下： ——消化缓冲液：  10 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；  0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0；  10％ SDS； ——20 mg/Ml 蛋白酶 K； ——苯酚； ——氯仿； ——无水乙醇； ——75％乙醇； 2.2.2 PCR 试剂 PCR 试剂如下： ——2×Taq PCR MsaterMix 试剂； ——特异性引物； ——阳性对照：ILT 活疫苗（含鸡传染性喉气管炎 K317 株病毒） 2.2.3 电泳试剂 电泳试剂如下： ——溴化乙锭； ——琼脂糖：电泳级； 1 DB34/T 1940—2013 ——电泳缓冲液 2.2.4 其他试剂 其他试剂如下： ——灭菌双蒸水； ——1 mol/L（灭菌）PBS：pH 7.2。 2.3 仪器设备及耗材 2.3.1 仪器设备 本方法使用下列仪器设备： ——PCR 仪； ——电泳仪； ——电泳槽； ——紫外光透射仪； ——凝胶成像系统； ——小型高速离心机； ——水浴锅； ——旋涡振荡器； ——乳钵或玻璃研磨器； ——微量加样器：100 µL～1000 µL、20 µL～200 µL、5 µL～50 µL 和 1 µL～10 µL 等多种规格。 2.3.2 一次性耗材 本方法使用下列一次性耗材： ——离心管（PP 材质）：1.5 mL； ——PCR 反应管（PP 材质）：0.2 mL； ——吸头：1 000 µL、200 µL、10 µL 等多种规格。 3 操作程序 3.1 喉头、气管组织样品的处理 无菌采取发病鸡的喉头、器官组织样品，置于灭菌乳钵中剪碎，充分研磨，用灭菌 PBS 溶液配成 1 ︰5 乳悬液,反复冻融 3 次。以 5 000r/min 离心 5 min，收集上清液，供 DNA 提取或置 -20℃保存 备用。 3.2 待检样品 DNA 提取 3.2.1 喉头、气管组织样品 DNA 提取 取处理好的样品 250 µL 于 1.5 mL 离心管中，每管加 400 µL 消化缓冲液（500 mmol/L Tris， 20 mmol/L EDTA，10 mmol/L NaCl，1％ SDS），加蛋白酶 K 至终浓度 100 µg/mL，混匀；50℃水浴 1 h。从水浴中取出消化后样品，每管加入饱和苯酚 600 µL，充分震荡摇匀，12000 r/min 离心 10 min； 取上清液约 400 µL，分别加入 200 µL 饱和苯酚和 200 µL 氯仿溶液，震荡摇匀，12000 r/min 离心 10 min；取上清液再加入 2.5 倍体积无水乙醇，摇匀后置 -20℃沉淀 30 min；10000 r/min 离心 10 min， 2 DB34/T 1940—2013 弃去上清液，加入 1 mL 75％的酒精洗涤沉淀一次，将所得核酸沉淀物放在 42℃烘箱内烘干或室温放 置自然晾干；每管中加入 30 µL TE 或灭菌双蒸水。获得的DNA 样品可直接进行 PCR 反应或置 -20℃ 保存备用。 3.3 PCR 检测 在冰浴条件下，按下列试剂用量在 PCR 反应管中分别加入各成分： ——2×PCRTaqMix 酶 12.5 µL ——50 mmol/LILV 检测上下游引物（A1 和 A2）：各 1 µL，终浓度为 1 mmol/L； ——待检样品 DNA：5 µL； ——灭菌双蒸水：补足至总体积为 25 µL。加完试剂后瞬时离心混匀。将 PCR 反应管置于 PCR 仪 内，按如下程序进行 PCR 反应：94℃预变性 3 min 后,进入循环 94℃变性 15 s, 53℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 30 个循环后, 72℃延伸 10 min。PCR 产物可直接进行琼脂糖凝胶电泳分 析或置 4℃保存备用。 3.4 阳性及阴性对照 3.4.1 阳性对照 用 ILT 活疫苗（含鸡传染性喉气管炎 K317 株病毒）作为阳性对照。 3.4.2 阴性对照 用灭菌双蒸水作为阴性对照。 3.5 电泳 3.5.1 3.5.2 3.5.3 3.5.4 3.5.5 3.5.6 4 制备 1.0％琼脂糖凝胶板。 取 5μL PCR 产物，与 0.5μL 加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。 加入分子量标准 DNA Marker。 盖好电泳仪，插好电极，将电压调至 90V 左右电泳，30～40min。 取出凝胶，置于紫外凝胶成像仪系统扫描、拍照。 以 DNA Marker 为参照分子量标准，判断 PCR 扩增片段大小。 结果判定 将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外光透射仪上观察，与标准 DNA 分子量比较，分析结果，然后可用 凝胶成像系统拍照保存。若待检样品在 329 bp 左右的位置出现一条特异性 DNA 条带，且与阳性对照 的 DNA 条带位置一致，则判定为鸡传染性喉气管炎阳性。 A _________________________________ 3