ICS 65.020.20 B 05 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 2404—2016 猪流行性腹泻病毒 RT-PCR 检测方法 2016 - 09 - 30 发布 河北省质量技术监督局 2016 - 12 - 01 实施 发 布 DB13/T 2404—2016 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由河北省畜牧局提出。 本标准起草单位：河北农业大学。 本标准主要起草人：袁万哲、孙继国、宋勤叶、马增军、金东航、李丽敏、张磊、李睿文。 I DB13/T 2404—2016 猪流行性腹泻病毒 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于检测猪粪便、 腹泻猪胃肠及其内容物和这些采集样品培养物中的猪流行性腹泻病毒。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）； dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）； EB：溴化乙锭（ethidium bromide）； PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）； RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）； RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reverse-transcription polymerase chain reaction）； Vero细胞：非洲绿猴肾细胞； cDNA ：互补脱氧核糖核酸。 3 主要仪器 3.1 PCR 仪。 3.2 凝胶成像系统。 3.3 台式低温高速离心机。 3.4 电泳仪。 3.5 电泳槽。 3.6 冰箱。 3.7 微量移液器。 3.8 水浴锅。 4 主要试剂 4.1 LS TRIzol RNA 提取试剂或其他商品化的 RNA 提取试剂。 4.2 氯仿。 4.3 1.0 % 琼脂糖凝胶：见附录 A 中 A.1。 4.4 50×TAE 缓冲液：见附录 A 中 A.2。 1 DB13/T 2404—2016 4.5 10 ug/μ L EB 或核酸染料：见附录 A 中 A.3。 4.6 DEPC 处理的灭菌的双蒸水：见附录 A 中 A.4。 4.7 DNA 分子量标准（100 bp）。 4.8 反转录酶。 4.9 RNA 酶抑制剂。 4.10 2×Taq MasterMix（Dye）。 4.11 dNTP。 4.12 商品化的一步法 RT-PCR 反应试剂：含有 RT-PCR 缓冲液，酶混合物，dNTP 混合物，无 RNA 酶的 水等。 5 引物 上游引物与下游引物见附录B。引物浓度为10 μmol/L。 6 样品对照 以灭活的猪流行性腹泻病毒Vero细胞培养物或者感染猪粪便、肠粘膜作为阳性对照，以正常Vero 细胞培养物或者是正常猪粪便、肠粘膜作为阴性对照。 7 操作步骤 7.1 样品的采集与处理。 7.1.1 采集工具 采集工具应经121℃±2℃，20 min高压灭菌并烘干。采集工具如下： a) 棉拭子； b) 剪刀； c) 镊子； d) 1.5 mL 离心管； e) 研钵。 7.1.2 粪便采集 将棉拭子深入肛门转一圈沾取粪便；将采集后的棉拭子放入盛有1.0 mL PBS（见附录A中A.5）的 1.5 mL的离心管，加盖，编号。 7.1.3 胃或肠及内容物的采集 用绳子将胃或肠两端扎紧，用剪刀采集胃肠等，装入一次性灭菌容器，编号。 7.1.4 样品储运 2 DB13/T 2404—2016 样品采集后放入密闭的塑料带内（一个采集点的样品放一个塑料带内），于保温箱中加冰，密封 24 h内送至实验室。 7.1.5 样品的处理 7.1.5.1 棉拭子处理方法 样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，弃去拭子，4 ℃条件下3000 r/min离心15 min，取上清液转入无菌的1.5 mL离心管中，编号备用。 7.1.5.2 胃或肠及内容物的处理方法 将所采集的胃或肠及内容物至于洁净，灭菌并烘干的搪瓷盘中，抽取内容物或者取刮取胃肠粘膜 按照质量体积比（1:1）加入样品保存液进行充分研磨，4 ℃条件下3000 r/min离心15 min。取上清转 入无菌的1.5 mL的离心管备用，编号。 7.2 RNA 的提取 7.2.1 用 LS TRIzol 试剂提取待检样品、阳性对照及阴性对照样品的 RNA。 7.2.2 将 250 μ L 经过预处理的待测样品加入 750 μ L TRIzol LS Reagent 中，振荡 2 min，室温放置 5 min。 7.2.3 加入 250 μ L 氯仿，在微量振荡器上振荡 1 min，室温放置 5 min 后，4 ℃条件下 12000 r/min 离心 15 min。 7.2.4 吸取上层水相转入一新的离心管中，加入等量的异丙醇，混匀，室温放置 15 min，4 ℃条件下 12000 r/min 离心 15 min。 7.2.5 小心吸弃上清液，加入 DEPC 处理的 75 % 乙醇 700 μ L～800 μ L，4 ℃条件下 12000 r/min 离 心 5 min。 7.2.6 小心吸弃上清液，将沉淀自然风干或于 50 ℃干燥箱中晾干，加适量的 DEPC 水溶解。 7.2.7 提取的 RNA 须在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增，若需长期保存，须至于-80 ℃的冰箱保存。 7.2.8 也可采用商品化的 RNA 提取试剂，按照说明书进行操作。同时进行阴阳对照样品 RNA 的提取。 7.3 RT-PCR 7.3.1 反转录反应（cDNA 的合成） 取上述步骤所得的病毒总RNA 11 μ L，加入2 μ L 浓度为10 µmol/L的反转录引物，加入4 μ L 5× 反转录缓冲液、0.5 μ L反转录酶、0.5 μ L RNA酶抑制剂、2 μ L dNTP Mixture，最终至总体积为20 μ L， 42 ℃水浴1 h，即得到cDNA溶液，直接用于下面的PCR扩增或-20 ℃冻存备用。 7.3.2 PCR 反应 在反应管中依次加入8 μ L无核酸酶水、10 μ L 2×Taq MasterMix (Dye)、1 μ L cDNA溶液、0.5 μ L 浓度为10 µmol/L的上游引物、0.5 μ L浓度为10 µmol/L的下游引物，最终至总体积为20 μ L，经 充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。 3 DB13/T 2404—2016 PCR扩增反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，循环30次； 72 ℃延伸5 min。 扩增反应结束后立即进行电泳或放置4 ℃备用。 8 扩增产物的电泳检测 制备1.0 % 琼脂糖凝胶板。在电泳槽内加入1×TAE电泳缓冲液，使液面超过凝胶。取3 μ L～5 μ L 扩增产物加到凝胶孔，加入分子量标准。恒压（110V）电泳30 min～40 min，将点用好的凝胶放到凝胶 成像系统上观察结果。 9 实验成立的描述 阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性的条带；阴性的扩增产物 没有预期的目的条带；阴阳性同时成立表明实验有效，否则实验无效。 10 结果判定 在试验结果成立的前提下，如果样品的RT-PCR产物电泳后在477 bp位置出现特异性的条带（RT-PCR 产物电泳图见附录C中C.1），则判定为猪流行性腹泻病毒核酸检测阳性；如果样品的RT-PCR产物电泳 后在477 bp位置未出现特异性的条带，则判定为猪流行性腹泻病毒核酸检测阴性。 4 DB13/T 2404—2016 附录A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 1.0%琼脂糖凝胶 称取琼脂糖 1.0 g，放入 100 mL 1×TAE 电泳缓冲液中，加热融化，温度降至 60 ℃时，加入 5 μ L 核酸染料，均匀铺板，厚度为 3 mm～5 mm。 A.2 50×TAE 电泳缓冲液 A.2.1 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0） 称取 EDTA 18.61 g，加灭菌双蒸水至 100 mL，后用氢氧化钠调 pH 至 8.0。 A.2.2 TAE 电泳缓冲液（50×） Tris 242 g，冰乙酸 57.1 mL，0.5 mol/L EDTA 100 mL，加灭菌双蒸水至 1000 mL。 A.3 溴化乙锭（EB）溶液 溴化乙锭 20 mg，加灭菌双蒸水至 20 mL。 A.4 DEPC 水 焦碳酸二乙酯（DEPC）50 μ L，加灭菌双蒸水至 100 mL，室温放置 6 h-8 h，121℃±2℃高压灭菌 20 min，分装到 1.5 mL DEPC 处理过的离心管。 A.5 PBS 缓冲液 A.5.1 A 液（0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液） ：NaH2PO4·H2O 27.6 g 先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏 水稀释至 1000 mL。 A.5.2 B 液（0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液） ：Na2HPO4·7H2O 53.6 g，（或 Na2HPO4·127H2O 71.6 g 或 Na2HPO4·2H2O 35.6 g）先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至 1000 mL。 A.5.3 0.01 mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲液的配制：. A 液 14 mL， B 液 36 mL，加氯化钠（NaCl） 8.5 g，最后用蒸馏水稀释至 1000 mL。 5 DB13/T 2404—2016 附录 B （规范性附录） 引 物 引物的名称、浓度及序列见表 B.1。 表 B.1 引物名称 引物浓度（μ mol/L） 序列（ 5'- 3'） 上游引物 10 ACG GGT GCC ATT ATC CCT CTA T 下游引物 10 GAC TGG TTG TTG CCT CTG TTG T 6 DB13/T 2404—2016 附录 C （规范性附录） 猪流行性腹泻病毒 RT-PCR 产物电泳图 猪流行性腹泻病毒 RT-PCR 产物电泳图见图 C.1。 M-DNA 分子量标准（100 bp） ； 1-阳性对照； 2-阴性对照。 图 C.1 猪流行性腹泻病毒 RT-PCR 产物电泳图 _________________________________ 7