ICS 11.220 B 41 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2515—2015 猪流行性腹泻病毒 RT-PCR 检测方法 RT-PCR assay for porcine epidemic diarrhea virus 文稿版次选择 2015 - 11 - 10 发布 安徽省质量技术监督局 2015 - 12 - 10 实施 发 布 DB34/T 2515—2015 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则编写。 本标准由安徽省农业标准化委员会归口。 本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。 本标准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准起草人：潘孝成、张丹俊、赵瑞宏、沈学怀、周学利、胡晓苗、戴银、侯宏艳、李贺侠、张 宁、何国荣、周德权、王庆。 I DB34/T 2515—2015 猪流行性腹泻病毒 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）RT-PCR 检测方法及 其技术要求。 本标准适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中 PEDV 核酸的检测。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction） RNA：核糖核酸（ribonucleic acid） DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） Taq 酶：Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus） PBS：磷酸缓冲液（phosphate buffer solution） TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（tris acetate-EDTA buffer） EB：溴化乙锭（ethidium bromide） 3 原理 PEDV 是一种 RNA 病毒。 RNA 反转录产生的 cDNA 可作为 PCR 模板进行扩增。 根据 PEDV 保守基因序列设计一对引物，在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA 为模板，以引物为延 伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链 DNA。 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 仪器 PCR 仪扩增仪。 台式低温高速离心机。 电泳仪。 凝胶成像系统。 冰箱。 微波炉。 分析天平。 1 DB34/T 2515—2015 4.8 水浴锅。 4.9 微量移液器。 5 试剂和材料 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 5.13 5.14 RNA 抽提试剂：Trizol。 氯仿、异丙醇、乙醇。 M-MLV 反转录酶。 RNA 酶抑制剂。 DEPC 处理的灭菌水。 Taq DNA 聚合酶。 dNTP。 DL2000 DNA Marker。 RT-PCR 反应试剂。 溴化乙锭（EB，10 µg/µL）或核酸染料。 磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.2），见附录 A 中的 A.1。 50×TAE 电泳缓冲液，见附录 A 中的 A.2。 1％琼脂糖凝胶，见附录 A 中的 A.3。 引物： ——上游引物 5’- GTGGTCGGAAGAGTAATAACATAC -3’ ， ——下游引物 5’- CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC -3’ ， ——引物浓度 10 pmol/µL。 5.15 阳性对照样品：PEDV 接种的 VERO 细胞培养物，阴性对照样品：正常 VERO 细胞培养物。 6 操作步骤 6.1 样品的采集及处理 6.1.1 采样工具 15 mL 离心管、1.5 mL 离心管、剪刀、镊子和研钵，经 121（±2）℃， 15 min 高压灭菌并烘干。 6.1.2 肠内容物的采集与处理 采取病死或剖杀猪的小肠内容物，按 1:5 倍体积加入 PBS，研磨冻融 3 次，装入 15 mL 灭菌离 心管中，8000 rpm 离心 10 min，取上清液转入 1.5 mL 离心管中，-80℃保存备用。 6.1.3 粪便的采集与前处理 取发病猪新鲜粪便，装入 15 mL 灭菌离心管中，按 1:5 倍体积加入 PBS，混匀，8000 rpm 离心 10 min，取上清液转入 1.5 mL 离心管中，-80℃保存备用。 6.1.4 细胞培养物 细胞培养物冻融 3 次，转入 1.5 mL 离心管中，-80℃保存备用。 6.2 RNA 提取 2 DB34/T 2515—2015 6.2.1 用 Trizol 提取待测样品、阳性对照和阴性对照样品的 RNA。 6.2.2 200 μL 的样品和 800 μL Trizol 置于一个 1.5 mL 离心管，反复颠倒混匀，室温静置 5 min。 6.2.3 12000 g 4℃离心 5 min，吸取上清移入新的离心管中，加入 200 μL 氯仿，用手剧烈振荡 15 s， 室温静置 5 min。 6.2.4 12000 g 4℃离心 15 min，吸取上层水相移入新的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混 匀，室温静置 10 min。 6.2.5 12000 g 4℃离心 10 min，小心弃去上清，加入 75％乙醇 1 mL（DEPC 水配制）。 6.2.6 12000 g 4℃离心 5 min，弃去乙醇，室温干燥 2～5 min，加入适量 DEPC 水，-80℃保存备用。 6.3 反转录 6.3.1 在 PCR 反应管中依次加入： ——Oligo dT Primer 1 μL ，dNTPs(10 mM) 1 μL ，实验样品 RNA 3 μL，DEPC 水 6 μL。 6.3.2 水浴锅或 PCR 仪中，65℃作用 5 min，冰上急冷 2 min。 6.3.3 在上述反应管中再依次加入： ——5×RT Buffer 4 μL，RNase Inhibitor（40 U/μL ）0.5 μL ，M-MLV 反转录酶（200 U/μL ）1 μL，DEPC 水 4. 5 μL。 6.3.4 PCR 仪中，42℃作用 60 min，再 70℃作用 15 min，-20℃保存备用。 6.4 PCR 6.4.1 PCR 反应体系 10×PCR Buffer 2.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，dNTPs(2.5 mml/L) 2 μL，Taq DNA 聚 合酶 0.25 μL，反转录产物 5 μL，灭菌去离子水 13.25 μL。 6.4.2 PCR 反应条件 94℃预变性 5 min 后；94℃ 1 min，52℃ 50 s，72℃ 1 min，35 个循环；最后 72℃延伸 10 min。 7 电泳 将 PCR 扩增产物 5 μL与 2 μL 上样缓冲液混合，点样于 1％琼脂糖凝胶板加样孔中，琼脂糖凝 胶板一侧点样孔加入 DL2000 DNA Marker（分子质量标准物），缓冲液为 1×TAE，以 5 V/cm 电压电 泳 30 min 左右。 8 结果判定 当阳性对照出现 663 bp 扩增条带，阴性对照未出现目的条带时，实验结果成立。 被检样品出现 663 bp 扩增条带为 PEDV 核酸阳性，未出现 663 bp 扩增条带的样品判为 PEDV 核 酸阴性。 图1 为一次检测结果图示。 3 DB34/T 2515—2015 M 1 2 3 2000bp- 1000bp7 50bp500bp250bp100bp- 图中： M —— DL2000 Marker； 1 —— 阴性对照样品； 2 —— 阳性对照样品； 3、4 —— 阳性样品。 图1 PCR 扩增电泳图 4 4 DB34/T 2515—2015 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂配制 A.1 0.01 mol/L pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 A.1.1 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 71.6 g，先加适量灭菌去离子 水溶解，最后定容至 1000 mL，混匀。 A.1.2 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O） 27.6 g，先加适量灭菌去离子水 溶解，最后定容至 1000 mL，混匀。 A.1.3 量取 0.2 moL/L 磷酸氢二钠溶液 36 mL，0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液 14 mL，称取氯化钠 8. 5 g，用灭菌去离子水溶解稀释至 1000 mL，4℃保存。 A.2 电泳缓冲液（50 倍） A.2.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0） ——二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯） ——灭菌双蒸水 ——氢氧化钠 ——灭菌双蒸水 18.61 g 80 mL 调 pH 至 8.0 加至 100 mL A.2.2 TAE 电泳缓冲液（50×） ——羟基甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯） ——冰乙酸 ——0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH 8.0) ——灭菌双蒸水 242 g 57.1 mL 100 mL 加至 1000 mL A.3 1％琼脂糖凝胶 ——琼脂糖（电泳级） 1 g ——1×TAE 电泳缓冲液 100 mL ——微波炉中完全融化，降温至 60℃左右，加核酸染料 5 μL，均匀铺板。 _________________________________ 5