ICS 07.100 C 04 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2563—2016 甲型 H1N1 流感病毒核酸检测 Real-time PCR 法 Real - time PCR method for the detection of H1N1 Influenza virus nucleic acid 2016 - 12 - 09 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 03 - 01 实施 发 布 DB22/T 2563—2016 前 言 本标准根据GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。 本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：柳鸿敏、李静、吴东林、臧希卉。 I DB22/T 2563—2016 甲型 H1N1 流感病毒核酸检测 Real-time PCR 法 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问 题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了甲型H1N1流感病毒核酸检测 Real-time PCR法。 本标准适用于甲型H1N1流感病毒核酸进行检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用 WS 285-2008 流行性感冒诊断标准 3 试剂与材料 3.1 试剂 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.2 水：无菌 RNase Free Water RNA 提取试剂：RNA 提取试剂盒 一步法反应试剂盒 病毒采样液：内带拭子 阳性对照和阴性对照 3.2.1 3.2.2 3.3 阳性对照：甲型 H1N1 流感病毒毒株提取的核酸，且稀释至 Ct 值在 20～30 之间 阴性对照：无菌 RNase Free Water 引物及探针 3.3.1 流感病毒 A 型特异性引物及探针 a) FluA-Forward：5’-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3’ b) FluA-Reverse：5’-GGG CAT TYT GGA CAA AKC GTC TAC G-3’ c) FluA-probe：FAM 5’-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG -3’BHQ1 3.3.2 甲型 H1N1 流感病毒特异性引物及探针 1 DB22/T 2563—2016 a) SWH1-Forward：5’-GGG TAG CCC CAT TGC AT-3’ b) SWH1-Reverse：5’-AGA GTG ATT CAC ACT CTG GAT TTC-3’ c) SWH1-Probe：FAM 5’-TGG GTA AAT GTA ACA TTG CTG GCT GG-3’ BHQ1 4 仪器和设备 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 5 漩涡振荡器 Real-time PCR 仪：配相应的反应管 高速离心机：8000 rpm～12 000 rpm 冷藏冰箱：2 ℃～8 ℃ 冷冻冰箱：-20 ℃ 生物安全柜：CLASS-Ⅱ型 微量移液器：10 μL，100 μL，200 μL，1000 μL 试验步骤 5.1 标本 5.1.1 鼻拭子 将拭子（3.1.4）平行于上颚插入鼻孔，旋转，保持数秒，待拭子头吸收分泌物以后，缓慢转动退 出。将拭子头浸入病毒采样液（3.1.4）中，弃去拭子尾部，待检。 5.1.2 咽拭子 用拭子（3.1.4）适度用力擦拭双侧扁桃体及咽后壁后，将拭子头浸入病毒采样液（3.1.4）中，弃 去拭子尾部，待检。 5.2 病毒的提取 将上述标本用漩涡振荡器（4.1）充分混匀后，取0.2 mL的病毒采样液置于无菌管中，按照RNA提取 试剂盒（3.1.2）的要求提取甲型H1N1流感病毒核酸。提取后的病毒核酸放置2 ℃～8 ℃冰箱（4.4）中， 如不能及时检测，放置-20 ℃冰箱（4.5）中冷冻保存。 5.3 5.3.1 Real-time PCR 反应 引物和探针配制 引物配制：新合成的引物开盖前用高速离心机（4.3）短暂离心15 s。用水（3.1.1）溶解，加水量 为10×引物的nmol数，充分混匀，此时引物浓度为100 μmol/L。将100 μmol/L的引物2.5倍稀释，此 时浓度为40 μmol/L。 探针配制：新合成的探针开盖前用高速离心机（4.3）短暂离心15 s。用水（3.1.1）溶解，加水量 为10×引物的nmol数，充分混匀，此时浓度为100 μmol/L。将100 μmol/L的探针5倍稀释，此时浓度 为20 μmol/L。 5.3.2 2 反应体系配制 DB22/T 2563—2016 25 μL反应体系： 2×RT-PCR Buffer 12.5 μL，25×RT-PCR Enzyme Mix 1 μL，40 μmol/L的 上、下游引物各0.5 μL，20 μmol/L的探针0.5 μL，RNA模板5 μL，用水（3.1.1）补足至25 μL。 设置阳性对照、阴性对照、空白对照和试剂对照。 5.3.3 Real-time PCR 反应条件 将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入Real-time PCR仪（4.2）进行扩增，反应条件如下： 45 ℃逆转录10 min；95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火45 s，40个循环。在60 ℃退火 时收集荧光信号。 6 结果判读 6.1 结果判定 流感病毒A型核酸与甲型H1N1流感病毒核酸检测均为阳性，则判断为标本阳性。如只有流感病毒A 型核酸检测为阳性，甲型H1N1流感病毒核酸检测为阴性，则判断为甲型H1N1流感病毒核酸检测阴性，建 议做流感病毒A型的其他型别检测。如流感病毒A型核酸检测为阴性，甲型H1N1流感病毒核酸检测为阳性， 则考虑实验检测过程中有甲型H1N1流感病毒核酸污染，建议重新进行试验。 阴性对照反应得到的荧光曲线不应超过阈值线，应无Ct值或为Ct值为零。如果阴性对照出现Ct值， 则说明实验过程受到污染，此次检测结果无效，应该严格按照操作程序重复实验。 阳性对照的检测结果应为阳性，且Ct值在20～30之间。如果阳性对照检测结果未达到要求，则需严 格按照操作程序重复试验。 当所有对照成立，检测标本在35个循环内出现荧光信号，且呈现典型S扩增曲线，则判断为甲型H1N1 流感病毒核酸检测阳性；若Ct值在35～40之间，应重复实验进行确认，如Ct值还在35～40之间，可判断 为甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性；若无Ct值或Ct值为零，则判断为甲型H1N1流感病毒核酸检测阴性。 6.2 结果表述 如判定结果为阳性，则结果表述应为“甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性”；如判定结果为阴性，则结 果表述应为“甲型H1N1流感病毒核酸检测阴性”。 7 7.1 7.2 7.3 废弃物处理及防治污染的措施 废弃物处置应按照 GB 19489-2008 的有关规定执行。 为了保护实验室人员安全，应由具备资格的工作人员进行检测。 检测过程中防止污染的措施见 WS/T 230-2002 中的相关规定。 _________________________________ 3