ICS 11.220 B 41 备案号：56330-2017 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 2629—2017 猪肠道微孢子虫检测 聚合酶链式反应 （PCR）法 Detection method of polymerase chain reaction (PCR) of Enterocytozoon bieneusi in pigs 2017 – 06 - 12 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 08 - 12 实施 发 布 DB22/T 2629—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。 本标准主要起草人：曹利利、郭衍冰、姚新华、苑淑贤、程荣华、姚琳、董航、邵洪泽。 I DB22/T 2629—2017 猪肠道微孢子虫检测 聚合酶链式反应（PCR）法 1 范围 本标准规定了猪肠道微孢子虫PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于猪肠道微孢子虫的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 猪肠道微孢子病 Intestinal microsporidiosis of pig 由肠道微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)引起的猪的一种以腹泻为主要特征的人兽共患病。 4 4.1 试剂、材料 试剂 除另有规定，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682的双重蒸馏水（ddH2O）。 4.1.1 粪便 DNA 提取试剂盒 4.1.2 10 mg/mL 溴化乙锭（EB）溶液（见附录 A.1） 4.1.3 50×TAE 电泳缓冲液（见附录 A.2） 4.1.4 1.5 %琼脂糖凝胶（见附录 A.3） 4.1.5 上样缓冲液（见附录 A.4） 4.1.6 10×PCR 缓冲液（见附录 A.5） 4.1.7 200U 或 2U/μL Taq DNA 聚合酶 4.1.8 10 mM dNTPs 4.1.9 标准分子量 DL 2000 Marker 4.1.10 1.4 g/mL CsCl 溶液（见附录 A.7） 4.1.11 猪肠道微孢子虫阳性对照：肠道微孢子虫基因组 DNA（10ng/μL）。 4.1.12 4 条引物序列及浓度见表 1。 1 DB22/T 2629—2017 表1 4.2 引物 引物序列 OUT-F 5’-GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT-3’ OUT-R 5’-AATACAGGATCACTTGGATCCGT-3’ IN-F 5’-AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG-3’ IN-R 5’- AATATCCCTAATACAGGATCACT-3’ 使用浓度 nmol/μL 10 材料 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6 4.2.7 5 引物序列及浓度 离心管（15 mL、50 mL、1.5 mL） 药品勺 称量纸 0.2 mL 薄壁 PCR 管 500 mL 量筒 500 mL 锥形瓶 吸头（10 μL、200 μL、1000 μL） 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 6 分析天平 PCR 扩增仪 台式低温高速离心机 核酸电泳仪 紫外凝胶成像仪 可调移液器（2 μL、20 μL、200 μL 、1000 μL） 恒温水浴锅 试验步骤 6.1 粪便样品处理 采集腹泻猪新鲜粪便样品约30 g，立即放入无菌处理的50 mL离心管中，加入35 mL ddH2O混匀，漩 涡震荡10 min，过300 目网筛；滤液转入50 mL离心管中，补充ddH2O至45 mL，室温1500 ×g离心10 min， 弃上清；沉淀用25 mL ddH2O 重悬，加入25 mL CsCl (1.4 g/ml)溶液混匀，室温300 ×g离心15 min； 吸取2 mL表层液体转入15 mL离心管中，加 ddH2O 至13 mL，平衡后室温1500 ×g离心10 min，弃上清； 沉淀用100 μL ddH2O 重悬，转入1.5 mL离心管，4 ℃保存备用。 6.2 基因组 DNA 提取 6.2.1 样本 DNA 提取 用粪便DNA提取试剂盒提取上述样本DNA，操作方法按说明书进行。 6.2.2 2 阳性样品 DNA 提取 DB22/T 2629—2017 用粪便DNA提取试剂盒提取猪肠道微孢子虫DNA，操作方法按说明书进行。 6.2.3 阴性对照 DNA 提取 健康猪粪便的DNA，获取方法同待检样品的处理方法。 6.3 空白对照 以ddH2O为模板，作空白对照。 6.4 PCR 扩增 6.4.1 第一轮扩增体系与条件 第一轮扩增体系见表2。 表2 第一轮 PCR 体系 成分 用量 10×PCR 缓冲液 5 μL dNTPs 1 μL Taq DNA聚合酶 1 μL OUT-F 2 μL OUT-R 2 μL 模板 10 μL ddH2O 29 μL PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸60 s，35个循环； 72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。 6.4.2 第二轮扩增体系与条件 第二轮扩增体系见表3。 表3 第二轮 PCR 体系 成分 用量 10×PCR 缓冲液 5 μL dNTPs 1 μL Taq DNA聚合酶 1 μL IN-F 2 μL IN-R 2 μL 模板 10 μL ddH2O 29 μL PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸60 s，35个循环； 72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。 3 DB22/T 2629—2017 6.5 电泳 制备1.5 %琼脂糖凝胶板（见附录A.3）。取8 μL第二轮 PCR产物，与2 μL上样缓冲液混合，加入 琼脂糖凝胶板的加样孔中， 相同方法加入阳性、阴性和空白对照PCR产物，加入标准分子量DL 2000 DNA marker，在5 V/cm电压条件下电泳30 min。用紫外凝胶成像仪观察结果。 7 结果判定 将电泳凝胶板置于紫外凝胶成像仪下观察、判断结果，当阳性对照出现392 bp扩增带，阴性和空白 对照未出现目的带时，实验结果成立：被检样品出现392 bp扩增带为猪肠道微孢子虫检测阳性，未出现 相应扩增带的样品判为阴性（见附录B.1）。必要时，取PCR产物进行测序并分析，目标DNA序列见附录B.2。 8 废弃物处理 检测过程中的废弃物及个人防护，应按GB 19489的规定执行。 4 DB22/T 2629—2017 附 录 A （规范性附录） 相关试剂配制 A.1 溴化乙锭（EB）溶液 溴化乙锭 ddH2O A.2 50×TAE 电泳缓冲液制备 A.2.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液配制（pH 8.0）。 二水乙二铵四乙酸二钠 ddH2O 氢氧化钠（1 mol/L NaOH） ddH2O A.2.2 18.6 g 80.0 mL 调pH 至8.0 加至100 mL 50×TAE电泳缓冲液配制 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 冰乙酸 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0） ddH2O 作电泳液使用时，用ddH2O进行50倍稀释。 A.3 0.2 g 加至20.0 mL 242.0 g 57.1 mL 100.0 mL 加至1 000 mL 1.5 %琼脂糖凝胶板制备 琼脂糖 1.5 g 50×TAE 电泳缓冲液 2.0 mL ddH2O 98.0 mL 微波炉中完全融化，待冷却至50～60 ℃时，加溴化乙锭（EB）溶液5 μL，摇匀，倒入电泳板上， 凝固后取下梳子，备用。 A.4 上样缓冲液 溴酚蓝0.2 g，加10 mL ddH2O过夜溶解。50 g蔗糖加入50 mL ddH2O溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶 液中，摇匀定容至100 mL。 A.5 10×PCR扩增缓冲液 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.8） 1 mol/L KC1 Nonidet P40 10.0 mL 50.0 mL 8.0 mL 5 DB22/T 2629—2017 1.5 mol/L MgCl2 ddH2O A.6 虫体消化液 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0） SDS 1 mol/L NaCl 100 mol/L EDTA ddH2O A.7 100.0 mL 10 mg 100.0 mL 100.0 mL 加至1L CsCl溶液(1.4 g/ml) CsCl ddH2O 6 1.0 mL 加至100 mL 31.0 g 50 mL DB22/T 2629—2017 AA 附 录 B （规范性附录） 引物 B.1 PCR扩增结果 注：M：DL 2000标准分子量；1：阳性标准对照；2：检测出的阳性样本；3：阴性对照；4：空白对照。 B.2 PCR产物测序结果 AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTGAATATCTATGGCTAGATAAAGTACAAGTCGTAACAAGGTTTCAGTTGGAGAACCAGC TGAAGGATCATTTTCAGTTTTTGGGGTGTGGGTATCGGAATGTGTGGTAGGTGATGTGTGTGTGTATGGGGGATGCCGAG GGCACCAGCGGTGCGGTGGTGTGTGCAGGCGTGAGAGTGTATCTGCAAGTGTGAGGGATGTGGGTGCAGCGAGTTAGAGG TGGTTCAATGTGGAATAGTGGGATTGGTACGTGATGGTTGGATGGGGGAATGATGTTTGTATGGGTGAGGAAAATCGGAG GTTGCGGTGCGAGCGGCAGTAGGGTGCCATCAAGAGGTGTATTTGGAAATATCCCTAATACAGGATCACT 注：下划线部分为第二轮PCR引物序列。 _________________________________ 7