ICS 65.020.30 B 44 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2611—2017 梅花鹿冷冻精液 Sika deer frozen semen 2017 - 05 - 08 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 06 - 08 实施 发 布 DB22/T 2611—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院特产研究所。 本标准主要起草人：杨镒峰、魏海军、许保增、赵伟刚、赵蒙、陈秀敏、鞠妍、曹新燕、薛海龙、 刁云飞、李晓霞、王世勇。 I DB22/T 2611—2017 梅花鹿冷冻精液 1 范围 本标准规定了梅花鹿冷冻精液的规格、标识、解冻后精子活力、前进运动精子数、畸形率、菌落数、 包装、储存运输。 本标准适用于梅花鹿冷冻精液的生产、销售和使用过程中精液的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用 于本文件。 GB/T 2828.11 计数抽样检验程序第11部分：小总体声称质量水平的评定程序 GB/T 5458 液氮生物容器 NY 1181 输精细管 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 冷冻精液 frozen semen 经处理后在液氮中（-196 ℃）冷冻保存的精液。 3.2 冻融精液 frozen-thawed semen 冷冻精液在39 ℃水浴解冻后的精液。 3.3 前进运动精子数 progressive motility 每支细管冻融精液中向前运动的精子数。 4 质量要求 4.1 细管 4.1.1 外观 应符合NY 1181要求。 4.1.2 规格 0.25 ml。 1 DB22/T 2611—2017 4.1.3 容量 ≥0.18 ml。 4.2 冻融精液 4.2.1 精子活力 ≥30%（即0.3）。 4.2.2 前进运动精子数 ≥1000万个/管。 4.2.3 畸形率 ≤18%。 4.2.4 细菌菌落数 ≤100 cfu/ml。 5 抽样 根据每头梅花鹿冷冻精液不同的生产批次进行抽样检测，抽样方法应符合GB/T 2828.11规定。 6 试验方法 应按附录A的要求执行。 7 储存 冷冻精液应装在包装物内，保存在液氮罐中，定期检查罐中液氮的量，并及时添加液氮以保持包装 物完全浸在液氮中，液氮罐应符合GB/T 5458的规定。 8 标识 细管标识应符合附录B的规定，包装物标识清晰。 9 运输 冷冻精液在运输过程中应保持液氮罐直立，包装物完全浸在液氮中。 2 DB22/T 2611—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 梅花鹿冷冻精液质量检测方法 A.1 解冻 A.1.1 器材 细管镊子、恒温水浴锅。 A.1.2 解冻方法 从液氮罐中取出细管冻精，放入到39 ℃的水浴锅中，完全融化即可。 A.2 容量 A.2.1 器材 细管剪、细管推针、1.0 ml量筒。 A.2.2 方法 解冻方法见A.1.2，用细管剪剪去封口端，用细管推针将精液全部注入到1.0 ml量筒内，读数即为 每支细管冷冻精液容量。 A.2.3 计算 如所检冻精为1支，则读数即为容量；如检测支数n≥2，按公式（A.1）计算： Q≡ Q1 + Q 2 + Qn n ................................. (A.1) 式中： Q ——细管冻融精液容量，单位为ml； Q1 ——第一支细管中精液容量，单位为ml； Q 2 ——第二支细管中精液容量，单位为ml； Qn ——第n支细管中精液容量，单位为ml； n ——检测冷冻精液支数。 A.3 精液质量检测 A.3.1 精子活力 3 DB22/T 2611—2017 A.3.1.1 器材 显微镜、精子动力分析系统、载玻片、盖玻片、移液器、枪头、小试管、试管架。 A.3.1.2 方法 解冻方法见A.1.2，用移液器取充分混匀后的解冻精液(或A.2.1检测后的样品）7 µl～10 µl置于 预热好的载玻片上，盖上盖玻片后，立即在显微镜下观察（10×或40×物镜）精子活力，也可使用精子 动力分析系统观察活力，分别观察三个视野进行全面评定。 A.3.1.3 计算 三个视野活力观察值的平均值按公式（A.2）计算： M = n1 + n 2 + n3 .................................. (A.2) 3 式中： M ——精子活力，%； n1 ——第一视野精子活力，%； n 2 ——第二视野精子活力，%； n3 ——第三视野精子活力，%。 A.3.2 A.3.2.1 前进运动精子数 器材 血细胞计数板、血色素管、显微镜或精子动力分析系统、计数器、小试管、试管架、血盖片、移液 器、枪头、1.0 ml吸管、3%氯化钠溶液。 A.3.2.2 方法 解冻方法见A.1.2，解冻后精液充分混匀后用血色素管或移液器吸取0.02 ml(或A.2.1检测后的样 品），缓慢注入到盛有0.98 ml的3%氯化钠溶液的试管内，充分混匀，配制成稀释50倍的精液。用吸管 吸取稀释后精液置于血盖片边缘，使精液自行流入计数室，均匀充满整个计数室，不允许有气泡，然后 在显微镜下或精子动力分析系统中观察计数。 A.3.2.3 计算 3 a) 每支细管冻融精液精子数=5 个方格中精子数×5（计数室内 25 个中方格中精子数）×10（1mm 内精子数）×1000（每毫升精子数）×50（稀释倍数）×容量 即为每支细管冻融精液精子数=5 个方格中精子数×250 万（细管）×容量 b) 每样品观察相邻两个计数室，取平均值；如两个计数室计数结果误差超过 5%，则应重新检测。 c) 每支细管冻融精液中前进运动精子数按式（A.3）计算： c = s × M ..................................... (A.3) 式中： c ——每支细管冻融精液前进运动精子数，单位为个； s ——每支细管冻融精液精子数，单位为个； M ——活力，%。 A.3.3 4 精子畸形率 DB22/T 2611—2017 A.3.3.1 器材 显微镜、天平、pH计、量筒、病理级载玻片、盖玻片、血球分类计数器、移液器、枪头、胶头滴管、 双蒸水、姬姆萨染料、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、碳酸镁、甲醇、甲醛、甘油、棕色试剂瓶。 A.3.3.2 试剂配制 a) 碳酸镁中和甲醛溶液 甲醛（40%） 500 ml 8.0 g MgCO3 完全溶解过滤后密闭保存于棕色试剂瓶中备用。 b) 福尔马林磷酸盐固定液 NaH2PO4·2H2O 0.55 g Na2HPO4·12H2O 2.25 g 40%甲醛溶液（经MgCO3中和） 8.0 ml 加0.89% NaCl溶液30 ml，待磷酸盐充分溶解，用0.89% NaCl溶液定容100 ml，静置24小时， 备用。 c) 磷酸缓冲液： NaH2PO4·2H2O 0.55 g Na2HPO4·12H2O 2.25 g 溶于双蒸水，定容至100 ml。 d) 姬姆萨原液： 姬姆萨染料 1.0 g 甘油 66.0 ml 甲醇 66.0 ml 称取姬姆萨染料，溶于少量甘油，于研钵内研磨至无颗粒，再将全部甘油倒入，置于56 ℃恒 温箱中2小时，然后加入甲醇，过滤后密闭保存于棕色试剂瓶中备用。 e) 姬姆萨染液 姬姆萨原液、磷酸缓冲液、双蒸水按体积比 2:3:5 的比例混合均匀，根据需要量、现用现配。 A.3.3.3 方法 精液解冻方法见 A.1.2，或使用精子活力检测的样品。 a) 抹片：取 10 µL 混匀后精液，滴于载玻片右端，取另一洁净、边缘平滑的载玻片以 45°角从 左侧接触精液滴，让精液沿着盖玻片底部扩散，然后由右向左推动载玻片使精液均匀涂抹在载 玻片上，载玻片标号，每个样品制作三个抹片。 b) 风干、固定：将制备好的抹片在自然条件下水平放置风干 5 min～20 min。将风干抹片放平， 用胶头滴管取 1.0 ml～2.0 ml 福尔马林磷酸盐缓冲固定液缓慢滴在涂片上，固定 15 min。 c) 水洗、染色：倒掉固定液，在蒸馏水中冲洗，自然风干。将涂片水平放置，用移液器取 2.0 ml 事先配制好的姬姆萨染液滴在涂片上，避免产生气泡，染色 3 小时。 d) 水洗、镜检：倒掉染色液，在蒸馏水中冲洗干净，自然风干后封片。用 40～60×物镜进行观 察，每次观察 200 个精子，计数畸形的精子数量，取三个样片平均值，三个样片间差异不能超 过 5%，如超过应重新制片。 e) 精子畸形率按式（A.4）计算： 5 DB22/T 2611—2017 A= A1 × 100 .................................. (A.4) S 式中： A ——精子畸形率，%； A1 ——畸形精子数，单位为个； S ——精子总数，单位为个。 A.4 菌落数检测 A.4.1 器材 培养箱、超净工作台、三角烧瓶、烧杯、量筒、天平、称量匙、高压灭菌锅、微波炉、培养皿、水 浴箱、pH计、牛皮纸、橡皮筋、记号笔、放大镜、酵母提取物、胰化蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、1 mol/L 盐酸、1 mol/L氢氧化钠，双蒸水。 A.4.2 培养基制作 酵母提取物 5.0 g 胰化蛋白胨 10.0 g 氯化钠 10.0 g 用双蒸水溶解后加琼脂粉15.0 g，微波炉加热溶解，调节pH至7.4～7.6，分装于三角烧瓶中用牛皮 纸密封后高压灭菌，待温度下降后在超净工作台内将培养基倒入培养皿内，静置使其凝固后，根据实际 情况标注编号。 A.4.3 方法 在超净工作台内按照无菌步骤操作，用移液器吸取解冻混匀后的精液20 µl，加注到培养皿内培养 基表面后，用接种针涂抹均匀后，静置十分钟后，与对照培养皿同时倒置放入37 ℃培养箱内，培养48 小时。每支精液涂三个平皿，培养后分别计数，计数时应将平板面对亮光，用记号笔在观察到菌落处做 标记，并用计数器计数、防止遗漏，必要时使用放大镜观察，菌落计数结果采用三个平皿的平均值。 A.4.4 计算 每支细管冻融精液的细菌菌落数按式（A.5）计算： B= n1 + n 2 + n3 × Q ÷ 0.02 .............................. (A.5) 3 式中： B ——细菌菌落