ICS 11.220 B 41 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1669—2017 牛布鲁氏菌病荧光纳米颗粒试纸条制备和 诊断方法 Preparation and diagnostic techniques for Brucellosis Bovis Using Test Strip of Luminescent Lanthanide Nanoparticles 2017 - 07 - 03 发布 福建省质量技术监督局 2017 - 10 - 03 实施 发 布 DB35/T 1669—2017 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 疫病概述 .......................................................................... 1 4 原理 .............................................................................. 2 5 仪器设备和主要试剂 ................................................................ 2 6 操作步骤 .......................................................................... 3 附录 A（规范性附录） 溶液的配制 ...................................................... 5 附录 B（资料性附录） 时间分辨荧光读数仪工作原理示意图 ................................ 6 附录 C（资料性附录） 牛布鲁氏菌荧光纳米颗粒试纸条检测结果示意图 ...................... 7 I DB35/T 1669—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由福建出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心、深圳市易瑞生物技术有限公司、福州 市疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：郑腾、张体银、唐寰宇、付辉、李文最、杨年松、朱海、王武军、张志灯、 白泉阳、李宋钰。 II DB35/T 1669—2017 牛布鲁氏菌病荧光纳米颗粒试纸条制备和诊断方法 1 范围 本标准规定了牛布鲁氏菌病的疫病概述，牛布鲁氏菌病荧光纳米颗粒试纸条制备和诊断的原理、仪 器设备和主要试剂及操作步骤。 本标准适用于牛布鲁氏菌病荧光纳米颗粒试纸条的制备和诊断，也适用于牛布鲁氏菌病的快速初 筛。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 疫病概述 布鲁氏菌病，又称“波状热”、“地中海弛张热”或“马耳他热”，是由布鲁氏菌（Brucella）引 起的一种人兽共患的慢性传染病。据90年代末的报告，全世界200多个国家和地区中有近170个存在人畜 布鲁氏菌病，遍布世界各大洲。全世界受布鲁氏菌病威胁的人约占l/5～1/6，布病患者约500万～600万， 每年新发病人约50万。我国人畜布鲁氏菌病疫情在20世纪50年代至70年代较严重，在80年代末至90年代 初曾得到较好控制，1992年发病率创中国历史最低，此后逐渐上升，发病区域不断扩大，成为严重的公 共卫生问题。 布鲁氏菌是一类不运动、需氧型的革兰氏阴性球杆菌或短杆菌，属于胞内寄生菌，菌体大小 约（0.5 μm～0.7 μm）×（0.6 μm～1.5 μm）。布鲁氏菌对营养要求较高，生长缓慢；在自然界广泛分 布且抵抗力比较强，在土壤、水、肉和乳类食品、粪尿、动物毛皮等自然状态下可以存活数周至几个月； 对光、热、多种消毒剂和抗生素类药物等很敏感，在上述条件下长则几小时、短则几分钟即可被杀死。 世界卫生组织（WHO）根据主要宿主和培养特性等将布鲁氏菌属分为牛种布鲁氏菌（Br.abortus）、猪 种布鲁氏菌（Br.suis）、羊种布鲁氏菌（Br.melitensis）、沙林鼠种布鲁氏菌（Br.neotomae）、绵羊种 布鲁氏菌（Br.ovis）和犬种布鲁氏菌（Br.canis）共6个种。布鲁氏菌可以感染人类及多种家畜或野生动 物，不同种各有不同的首选宿主；临床上以羊、牛、猪三种布鲁氏菌意义最大，其中羊种布鲁氏菌致病 力最强。牛布鲁氏菌病的特点是生殖器官、胎膜及多种器官组织发炎、坏死和肉芽肿的形成，引起流产、 不孕、睾丸及关节炎等症状。可见胎儿败血症变化，组织器官（子宫、乳房、胎衣、睾丸及副睾）的炎 性反应（渗出、坏死、化脓或干酪化）及细胞增生形成肉芽肿（结节由上皮样细胞及巨噬细胞组成）至 瘢痕化。 染病的家畜和野生动物是人与动物布鲁氏菌病主要的传播源。其中牛、羊和猪是牛布鲁氏菌病的主 要传播源，在人际间的传播很少发生。布鲁氏菌病可以通过空气传播或接触传播，其感染途径有呼吸道、 消化道、粘膜和破损的皮肤等。健康的人或动物通常是由于直接或间接接触患病的动物及其污染物、食 1 DB35/T 1669—2017 用或饮用各种被污染的产品或水源、吸入污染的空气等而感染布鲁氏菌病。然而，宿主感染布鲁氏菌后 不一定立即表现出临床症状。布鲁氏菌可以在宿主体内潜伏数周至数年。 4 原理 本标准采用基于稀土荧光纳米颗粒的荧光免疫层析技术对牛布鲁氏菌病抗体进行检测。检测时，在 层析作用下，经处理后的待测牛血清由样品垫流经结合垫，从而到达层析膜。如果样品中含有目标待测 物，则会与结合垫上释放的荧光纳米颗粒标记的抗原反应；当到达检测线时，目标待测物与检测线上包 被的物质发生反应并被拦截在检测线上，通过激发光激发，检测线显色。反之，如果没有目标待测物， 检测线则不显色。 5 仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 5.1.6 5.1.7 5.1.8 微量可调移液器（10 μL、200 μL、1 000 μL）。 恒温箱（25 ℃±1 ℃）。 冷冻高速离心机。 除湿机。 切条机。 划膜喷金机。 冰箱（2 ℃～8 ℃）。 时间分辨荧光读数仪。 5.2 主要试剂和耗材 除另有规定外，本标准所用试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水应符合GB/T 6682—2008中一级 水的要求。 5.2.1 水溶性量子点。 5.2.2 碳二酰亚胺盐（EDC）。 5.2.3 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。 5.2.4 抗原 PB26。 5.2.5 甘氨酸。 5.2.6 磷酸盐缓冲溶液（PBS）。 5.2.7 牛血清白蛋白（BSA）。 5.2.8 吐温 20（Tween-20）。 5.2.9 叠氮钠（NaN3）。 5.2.10 ProteinG 蛋白。 5.2.11 羊抗鼠二抗。 5.2.12 硝酸纤维素膜。 5.2.13 玻璃纤维结合垫。 5.2.14 聚氯乙烯底板（PVC 底板）。 5.2.15 吸水滤纸。 5.2.16 样品垫。 2 DB35/T 1669—2017 5.2.17 牛布鲁氏菌病阳性血清和阴性血清，由指定单位提供。 6 操作步骤 6.1 牛布鲁氏菌病荧光纳米颗粒试纸条的制备 6.1.1 荧光纳米颗粒的制备 6.1.1.1 用 0.01 mol/L PBS（pH7.6）（配制方法见附录 A 中 A.1）溶解水溶性量子点，取溶解后的 10 mg/mL 水溶性量子点 300 μL 加入 200 μL 的 60 mg/mL EDC 溶液（配制方法见附录 A 中 A.2），振荡混 匀。 6.1.1.2 再加入 1 mL 的 0.2 mg/mL NHS 溶液（配制方法见附录 A 中 A.3），混匀。25 ℃±1 ℃下温 和搅拌，反应 60 min。 6.1.1.3 在搅拌条件下，缓慢加入 1 mL 用 0.01 mol/L PBS（pH7.6）溶解的 ProteinG 蛋白（2 mg/mL）。 25 ℃±1 ℃下温和搅拌，反应 60 min。 6.1.1.4 再加入 100 μL 的 0.2 mol/L 甘氨酸（配制方法见附录 A 中 A.4），25 ℃±1 ℃下温和搅拌， 反应 5 min 后终止反应。 6.1.1.5 将以上 6.1.1.4 中的溶液在 4 ℃下，14 000 r/min 离心 15 min，弃去上清液，收集荧光纳米颗 粒。 6.1.1.6 在荧光纳米颗粒中加入 5 mL 的 0.01 mol/L PBS（pH7.6），重悬荧光纳米颗粒（必要时，可 以在超声条件下重悬），在 4 ℃下 14 000 r/min 离心 15 min，弃去上清液，收集荧光纳米颗粒。 6.1.1.7 重复 6.1.1.6 中的步骤 2 次，最后用 3 mL 重悬液（配制方法见附录 A 中 A.5）重悬荧光纳米 颗粒。 6.1.2 样品垫的处理 将样品垫放入处理液（配制方法见附录A中A.6）中完全浸湿，取出后，在25 ℃±5 ℃和相对湿度 小于40%的条件下，干燥样品垫，干燥时间超过24 h后，密封保存备用。 6.1.3 玻璃纤维结合垫的处理 取6.1.1.7中制备的荧光纳米颗粒重悬液100 μL用重悬液稀释20倍。每一条结合垫用1 mL以上稀释过 的荧光纳米颗粒重悬液均匀铺满。在25 ℃±5 ℃和相对湿度小于40%的条件下干燥样品垫，干燥时间超 过24 h后，密封保存备用。 6.1.4 硝酸纤维素膜的划线 6.1.4.1 用抗原 PB26 划检测线（T 线），条件为：用含有 0.5% BSA（w/v）的 0.01 mol/L PBS（pH7.6） 配制浓度为 2 mg/mL 的抗原划线，划线量为 1 μL/cm。 6.1.4.2 用羊抗鼠二抗（3 m