ICS 11.220 B 41 福 DB35 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1712—2017 鸭短喙侏儒综合征诊断技术 Diagnostic technique for beak atrophy and dwarfism syndrome in ducks 2017 - 12 - 25 发布 福建省质量技术监督局 2018 - 03 - 25 实施 发 布 福 建 省 地 方 标 准 鸭短喙侏儒综合征诊断技术 DB35/T 1712—2017 * 2017 年 12 月第一版 2017 年 12 月第一次印刷 DB35/T 1712—2017 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 疫病概述 .......................................................................... 1 3 临床诊断 .......................................................................... 1 4 限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）诊断 .................................. 2 5 结果判定 .......................................................................... 3 附录 A（规范性附录） 相关试剂的配制 .................................................. 4 附录 B（资料性附录） 电泳结果 ........................................................ 6 I DB35/T 1712—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心、 江西省萍乡市科学技术情报研究所。 本标准主要起草人：黄瑜、万春和、傅秋玲、施少华、黄勇、傅光华、程龙飞、张体银、刘荣昌、 陈翠腾、陈红梅、陈珍、朱春华。 II DB35/T 1712—2017 鸭短喙侏儒综合征诊断技术 1 范围 本标准规定了鸭短喙侏儒综合征诊断技术涉及的临床诊断、限制性片段长度多态性聚合酶链反应 （PCR-RFLP）诊断和结果判定的操作技术规程。 本标准适用于鸭（包括番鸭、半番鸭、北京鸭、樱桃谷北京鸭等）短喙侏儒综合征的临床诊断和实 验室诊断。 2 疫病概述 自2009年以来，我国华东地区部分番鸭、半番鸭和樱桃谷北京鸭发生以喙变短、舌头外露、个别死 亡、耐过鸭出现生长障碍（即侏儒）、残次鸭比例高为主要临床特征的疫病，俗称鸭“短喙症”、“大 舌头病”，各日龄鸭均有发生，主要剖检病变为腿或翅骨折、胸腺出血和部分成年鸭卵巢萎缩，目前统 称为鸭短喙侏儒综合征（beak atrophy and dwarfism syndrome，BADS）。 经研究确定该病病原随发病地区和发病鸭品种的不同而有所差异，引起闽、浙、苏等省番鸭、半番 鸭短喙侏儒综合征的病原为新型番鸭细小病毒（novel Muscovy duck parvovirus，N-MDPV）；而引起 鲁、苏、闽等省樱桃谷北京鸭、北京鸭、半番鸭短喙侏儒综合征的病原为新型鹅细小病毒（novel goose parvovirus，N-GPV），且其临床症状和病理变化明显有别于原经典的番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小 病毒（GPV）所致的临床表现。 3 3.1 临床诊断 临床症状 当鸭出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据之一： a) 短喙； b) 生长不良，表现矮小、侏儒； c) 舌头外露； d) 行走异常。 3.2 剖检病变 当鸭出现以下部分或全部剖检病变时，可作为初步诊断的依据之一： a) 胸腺出血； b) 腿或翅骨折； c) 部分鸭胸腺或卵巢萎缩。 3.3 初步诊断 当鸭出现3.1的临床症状之一或3.2中剖检病变之一时，可做出初步诊断；需确诊，应进行实验室进 一步诊断。 1 DB35/T 1712—2017 4 限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）诊断 4.1 样品采集与处理 采集可疑病鸭的胸腺、肝脏或（和）卵巢，尽快冷藏。将采集的组织剪碎处理后，按体积比1：3 的比例加入磷酸盐缓冲液（PBS，见附录A中A.1的规定）制成组织匀浆液，反复冻融3次，经8 000 r/min 离心20 min后取上清液分装冻存备用。 4.2 实验仪器设备 主要仪器设备包括： a) PCR 仪； b) 高速台式冷冻离心机； c) 微量移液器； d) 组织匀浆器； e) 电泳仪； f) 电泳槽； g) 紫外凝胶成像系统。 4.3 实验试剂 主要试剂包括： a) 10%的十二烷基磺酸钠（SDS）； b) 蛋白酶 K（10 mg/mL）； c) 异丙醇； d) Tris·饱和酚； e) 酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1）； f) 乙酸钠（3 mol/L，pH5.4）； g) 无水乙醇； h) 75%乙醇； i) 核糖核酸酶（RNAse A，10 mg/mL）； j) 灭菌双蒸水。 4.4 引物 根据新型番鸭细小病毒（N-MDPV）和新型鹅细小病毒（N-GPV）基因组编码区的非结构蛋白NS基因 保守区设计一对病毒特异性引物（上游引物F ：5’-CAATGGGCTTTTACCAATATGC-3′和下游引物R ：5′ATTTTTCCCTCCTCCCACCA-3′）。以灭菌双蒸水将引物均稀释至终浓度20 μM，分装冻存备用。 4.5 核酸提取 按下列步骤提取核酸： a) 取 420 μL 组织匀浆液和 30 μL 核糖核酸酶加入 1.5 mL 灭菌离心管混匀后，室温作用 20 min； b) 取 40 μL 10% 十二烷基硫酸钠溶液和 10 μL 蛋白酶 K 溶液，56 ℃水浴 2 h； c) 加入等量的 Tris·饱和酚，反复颠倒充分混匀，12 000 r/min 离心 5 min ，小心吸取上层水 相于另一 1.5 mL 灭菌离心管中； 2 DB35/T 1712—2017 d) 加入等量的酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1），颠倒充分混匀，12 000 r/min 离心 5 min ，小 心吸取上层水相于另一 1.5 mL 灭菌离心管中； e) 加入 1/10 体积的乙酸钠、2 倍体积冰冻预冷的无水乙醇混匀后，－20 ℃放置 2 h。12 000 r/min 离心 15 min，弃去乙醇。加入 600 μL 75 %冰冻预冷的乙醇清洗 2 次，倒置于吸水纸上 5 min， 室温晾干。加入 20 μL 灭菌双蒸水溶解沉淀，－20 ℃放置备用。 也可采用市售商品化的等效核酸DNA提取试剂盒，并按其说明书操作。 4.6 对照 以灭活的新型番鸭细小病毒（N-MDPV）和新型鹅细小病毒（N-GPV）提取的核酸为阳性对照，以灭 活的其他鸭源病毒提取的核酸为阴性对照，以灭菌双蒸水为空白对照。 4.7 PCR 扩增 PCR反应体系为50 μL，每个反应管的反应液配置为：依次加入5 μL 10×PCR缓冲液，上下游引物 各1 μL，4 μL dNTP Mixture，1 μL提取的核酸DNA，37.5 μL灭菌双蒸水，0.5 μL Taq聚合酶。2000 r/min 离心15 s，使反应混合液都沉降到PCR管底。 将上述反应混合液按照以下步骤进行PCR扩增，94 ℃预变性5 min； 循环参数为94 ℃变性50 s、 55 ℃退火30 s、72 ℃延伸35 s，循环35次； 72 ℃延伸7 min结束。 也可采用市售商品化的等效PCR检测试剂盒，并按其说明书操作。 4.8 酶切 PCR扩增反应结束后，分别取20 μL PCR产物、3 μL 10×H缓冲液、5 μL灭菌双蒸水和2 μL EcoRⅠ 酶混匀，2000 r/min离心15 s使混合液沉至管底，37 ℃水浴60 min。 也可采用市售商品化的等效快速EcoRⅠ内切酶，并按其说明书操作。 4.9 酶切产物电泳 按4.8操作反应结束后，分别取5 μL 酶切产物与0.5 μL10×加样缓冲液混合，加入到1.0%琼脂糖凝 胶（见附录A中A.7的规定）样品孔中，以5 μL DNA分子量标准（DL2000 DNA Marker）作为电泳条带大 小对照，经5 V/cm的电压电泳30 min后，以紫外凝胶成像系统进行观察。 5 结果判定 5.1 新型鹅细小病毒阳性对照酶切产物电泳仅出现对应大小（641 bp）条带（参见附录 B 中图 B.1 第 1 泳道），新型番鸭细小病毒阳性对照酶切产物电泳出现两个对应大小（463 bp 和 178 bp）的条带（参 见附录 B 中图 B.1 第 2 泳道），且阴性对照无此电泳条带（参见附录 B 中图 B.1 第 3 泳道）时，判定检 测试验成立；否则，判定检测试验不成立，不能进行下面的判定。 5.2 酶切产物电泳仅出现对应大小（641 bp）条带（参见附录 B 中图 B.1 第 4 泳道），判定为新型鹅 细小病毒核酸阳性；否则判定为新型鹅细小病毒核酸阴性（参见附录 B 中图 B.1 第 7 泳道）。 5.3 酶切产物电泳出现两个对应大小（463 bp 和 178 bp）条带（参见附录 B 中图 B.1 第 5 泳道），判 定为新型番鸭细小病毒核酸阳性；否则判定为新型番鸭细小病毒核酸阴性（参见附录 B 中图 B.1 第 7 泳道）。 5.4 酶切产物电泳出现三个对应大小（641 bp、463 bp 和 178 bp）条带（参见附录 B 中图 B.1 第 6 泳道），判定为新型鹅细小病毒和新型番鸭细小病毒共感染核酸阳性；否则判定为新型鹅细小病毒和新 型番鸭细小病毒共感染核酸阴性（参见附录 B 中图 B.1 第 7 泳道）。 3 DB35/T 1712—2017 附 录 A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 0.01M 磷酸盐缓冲液（PBS） NaCl 8.0 g KCl