(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111200113.2 (22)申请日 2021.10.14 (71)申请人 吉林大学 地址 吉林省长 春市前进大街269 9号 (72)发明人 刘建宇　高庆杰　张文科　 (74)专利代理 机构 北京易捷胜知识产权代理事 务所(普通 合伙) 11613 代理人 齐胜杰　齐云 (51)Int.Cl. C12N 15/115(2010.01) A61K 31/713(2006.01) A61P 7/02(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种pH响应的智能抗凝血核酸适配体及其 应用和药物 (57)摘要 本发明涉及一种pH响应的智能抗凝血核酸 适配体， 该抗凝 血核酸适配体为HD1 ‑HD22二价适 配体， HD1适配体或其衍生物与HD22适配体或其 衍生物之间以桥臂连接， 该桥臂为具有pH响应特 性 的 序 列 ；该 桥 臂 序 列 为 5 ' ‑ T T C C T A T C CG T T C CG A T C CG ‑3 '或 5 ' ‑ TTCCTATCCGTTCCAATCCG ‑3'； 该桥臂富含C碱基的 核酸序列， 能在酸性条件下发生折叠缩短长度的 特性， 且该桥臂不会与HD1和HD22序列中的G碱基 形成碱基互补及破坏单链适配体的结构和功能， 通过这样的桥臂凝血酶适配体HD1和HD22连接， 得到pH响应智能性抗凝血二价适配体， 其不仅具 有普通二价适配体的优良特性， 还能解决在抗癌 栓治疗的同时预防癌症病灶压迫血管薄弱部位 导致大出血或因血小板减小导致癌症病灶压迫 血管部位的出 血不止的问题。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图1页 CN 114350668 A 2022.04.15 CN 114350668 A 1.一种pH响应的智能抗凝血核酸适配体， 其特征在于， 该抗凝血核酸适配体具有pH响 应特性， 在中性pH血液中发挥正常抗凝血功能而在酸性pH血液中抗凝血功能下降； 该抗凝 血核酸适配体为HD1 ‑HD22二价适配体， HD1适配体或其衍生物与HD22适配体或其衍生物之 间以桥臂连接， 该桥臂为具有pH响应特性的序列； 该桥臂序列为 如SEQ ID NO.1所示的5' ‑TTCCTATCCGTTCCGATCCG‑3'或者 如SEQ ID NO.2所示的5' ‑TTCCTATCCGTTCCAATCCG‑3'。 2.一种pH响应的智能抗凝血核酸适配体， 其特征在于， 所述抗凝血核酸适配体的序列 为： 如SEQ ID NO.3所示的 GGTTGGTATGGTTGGTTCCTATCCGTTCCGATCCGAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT； 或者 如SEQ ID NO.4所示的 GGTTGGTGTGGTTGGTTCCTATCCGTTCCAATCCGAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT。 3.根据权利要求1或2所述的pH响应的智能抗凝血核酸适配体作为肿瘤抗血栓治疗药 物的应用。 4.一种肿瘤抗血栓DNA核酸药物， 其特征在于， 所述肿瘤抗血栓DNA核酸药物中包含一 段抗凝血核酸 适配体， 所述抗凝血核酸 适配体的序列为： 如SEQ ID NO.3所示的 GGTTGGTATGGTTGGTTCCTATCCGTTCCGATCCGAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT； 或者 如SEQ ID NO.4所示的 GGTTGGTGTGGTTGGTTCCTATCCGTTCCAATCCGAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114350668 A 2一种pH响应的智能抗凝血核酸适配体及其应用和药物 技术领域 [0001]本发明涉及生物药物技术领域， 尤其涉及一种pH响应的智能抗凝血核酸适配体及 其应用和药物。 背景技术 [0002]癌栓是肿瘤常见并发症之一。 近年来研究发现恶性肿瘤患者普遍存在凝血异常， 高凝状态易并发血栓的形成,是仅次于恶性肿瘤本身引起患者死亡 的第二位原因。 癌栓是 指癌细胞在生长、 繁殖、 转移过程中， 侵袭或堆集血管和淋巴系统， 或引起血液的凝血异常， 导致血管功能和血液运行障碍、 异常凝血、 血栓形成， 产生一系列病理生理改变的肿瘤并发 症。 90％以上 的恶性肿瘤患者可出现凝血系统相关指标异常。 此症影响肿瘤病人的生存期 和生存质量， 发生在人体重要组织和器官 的癌栓更严重地危及肿瘤病 人的生命， 甚至使病 人很快死亡。 癌栓可发生在大小动静脉、 淋巴管、 微循环， 所引起的临床症状和体征复杂。 在 术后不久， 癌症患者死于肺栓塞的可能性是普通外科患者的四倍。 事实上， 癌症患者早期死 亡的10％是由于肺栓塞。 但是在癌症患者术后治疗中， 在抗癌栓治疗的同时还要预防癌症 病灶压迫血管薄弱部位导致大出血或因血小板减小导致癌症病灶压迫血管部位的出血不 止的问题。 正是由于这个因素， 虽然华法林可减少8 5％的血栓栓塞事件， 但由于担心 导致出 血而没有被广泛采用。 因此， 迫切需要提供一种智能的能够在非病灶部位正常发挥抗血栓 作用而在癌症病灶部位又能够降低出 血风险的抗血栓药物。 [0003]HD1、 HD22、 HD1 ‑HD22为目前已经报道的凝血酶核酸适配体。 HD1  凝血酶适配体包 含有十五个核苷 酸的单链核酸序列  5'‑GGTTGGTGTGGTTGG ‑3'， 该序列与人α ‑凝血酶的外部 酶催化位点I 相互作用， 而这个位点原本是用来键合纤维 蛋白原的， 因此当HD1键合了凝血 酶的催化位点I后， 就会起到抑制血小板聚集、 纤维蛋白原活化等作用。 HD1显示出对凝血酶 的良好特异性和亲和力， 结合常数大约在二十五到二百纳摩儿每毫升。 在纯化的纤维蛋白 原中， HD1延长了凝血时间， 使凝血时间从25秒延长到了169秒， 在真实的体系人血浆中， 从 25 秒延长到了43秒。 HD1抑制血小板 聚集(0.5U/mL凝血酶)的IC50约为七十到八十纳摩尔 每升， 远低于水蛭素的1.7微摩尔每升。 研究证实， 凝血酶核酸适配体HD1与肝素相比， 能够 更有效的抑制凝块结合凝血酶。 [0004]HD22为1997年NeXstar  Pharmaceuticals公司的Diane  M.Tasset和科罗拉多大学 分子细胞与发育生物学系Walter  Steiner和他们的同事们发现的第二种凝血酶结合适配 体， 其包含有29个核苷酸的序列  (5'‑AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGA CT‑3')或27个核苷酸 的序列(缺少29聚体形式的第一个和最后一个核苷酸)的优化适配体。 HD22  与凝血酶的结 合常数能够达到500纳摩尔每毫升。 HD22识别凝血酶外部位点II。 HD22双链部分的核苷酸 G23， T24， G2 5， A26， C27和G4部分的T9， T18， T19， G2 0核苷酸有助于与凝血酶的外部位点II的 相互作用。 由于凝血酶外部位点II是带正电荷的基序， 因此它与HD22主链产生许多离子对， 尤其在双链体区域。 在G4区域(T9， T18和T10)中观 察到疏水相互作用， 这稳定了复合物的形 成。 此外， 与凝血酶的相互作用改善了HD22结构的热稳定性， 并导致熔融温度从36℃增加到说　明　书 1/7 页 3 CN 114350668 A 3