ICS 11.220 B 41 福 DB35 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1822—2019 水禽圆环病毒感染 PCR 鉴别诊断技术 PCR diagnostic techniques for differentiating circovirus infection in waterfowls 2019 - 04 - 18 发布 福建省市场监督管理局 2019 - 07 - 18 实施 发 布 DB35/T 1822—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 疫病简述 .......................................................................... 1 3 PCR 鉴别诊断....................................................................... 1 附录 A（规范性附录） 相关试剂的配制 .................................................. 4 附录 B（资料性附录） 参考序列 ........................................................ 6 附录 C（资料性附录） PCR 检测结果电泳图例 ............................................ 7 I DB35/T 1822—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业农村厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福州海关技术中心、江西省萍乡市科学技术 情报研究所、宁德海关检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：傅光华、施少华、黄勇、彭春香、傅秋玲、黄瑜、白泉阳、叶洪、万春和、 程龙飞、陈红梅、刘荣昌、陈珍、陈翠腾、朱春华、吴波平、庄晓东。 II DB35/T 1822—2019 水禽圆环病毒感染 PCR 鉴别诊断技术 1 范围 本标准规定了水禽圆环病毒感染PCR鉴别诊断的操作技术要求。 本标准适用于鸭圆环病毒、鹅圆环病毒感染的鉴别诊断。 2 疫病简述 水禽圆环病毒（Waterfowl circovirus）为圆环病毒科圆环病毒属的成员，主要包括鸭圆环病毒 （Duck circovirus,DuCV）和鹅圆环病毒（Goose circovirus,GoCV），基因组均为环状单股正链DNA。 DuCV可感染不同品种、日龄的鸭，GoCV可感染不同品种、不同日龄的鹅。水禽圆环病毒主要侵害水 禽免疫系统，导致宿主免疫应答机能下降，临床上造成被感染动物生长迟缓，并易引起其他细菌和病毒 的继发或混合感染。 3 PCR 鉴别诊断 3.1 仪器设备 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 3.2 PCR 仪。 台式冷冻离心机（转速不低于 12 000 r/min）。 微量移液器。 组织匀浆器。 电泳仪。 电泳槽。 紫外凝胶成像系统。 试剂 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.2.6 3.2.7 3.2.8 3.2.9 3.2.10 3.2.11 3.2.12 蛋白酶 K。 10%十二烷基苯磺酸钠（SDS）：配制方法见附录 A 的 A.1。 Tris 饱和苯酚。 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。 3 mol/L 的醋酸钠溶液：配制方法见附录 A 的 A.2。 无水乙醇。 75%乙醇：配制方法见附录 A 的 A.3。 溴化乙锭溶液：配制方法见附录 A 的 A.4。 1×TAE 缓冲液：配制方法见附录 A 的 A.5。 1.0%琼脂糖凝胶：配制方法见附录 A 的 A.6。 DNA 相对分子质量标准物：100 bp ladder。 10×加样缓冲液：配制方法见附录 A 的 A.7。 1 DB35/T 1822—2019 3.3 样品的采集与处理 样品的采集与处理依照国家采样标准执行，具体如下：无菌采集生长不良、羽毛紊乱、体况消瘦或 发病鸭（鹅）的法氏囊、脾脏等器官，剪碎后与磷酸盐缓冲液（PBS，见附录A的A.8）按体积比1：5的 比例制成组织匀浆液，反复冻融3次，8 000 r/min离心30 min，取上清，用于DNA抽提，或置-20 ℃冻 存备用。 若采集的样品需放置6 h以上再进行处理，应先置-20 ℃条件下保存备用，需托运时应确保冷藏或 冰冻状态运输。 3.4 引物设计 根据水禽（鸭、鹅）圆环病毒两个主要蛋白基因3′之间的间隔序列差异设计3条特异性引物： CVF：5′- AAY CWC GCG GGA AGT GGT GGG A -3′； DuCVR：5′- TTC TAR GCA TAA ACG AGA TC -3′； GoCVR：5′- ATA MGA TTC GGA CAA TGG ACT G -3′。 其中，CVF为共用上游引物，CVF与DuCVR用于检测DuCV，扩增条带为554 bp大小的基因片段，CVF 与GoCVR用于检测GoCV，扩增条带为407 bp大小的基因片段。各引物的工作浓度均为 10 mmol/L，保存 于4 ℃～8 ℃条件下。 3.5 样品中病毒 DNA 提取 3.5.1 常规 DNA 提取步骤： 3.5.1.1 取 540 μL 匀浆液上清，加入 60 μL 10%的 SDS，加入蛋白酶 K 至终浓度 5 mg/mL，充分混 匀 15 s，56 ℃水浴 2 h。 3.5.1.2 加入等体积 Tris 饱和苯酚，充分混匀 15 s，在 4 ℃条件下 12 000 r/min 离心 15 min。 3.5.1.3 吸取离心后各管中的上清液转移至灭菌管(注意不要吸出中间层)，加入与上清液等体积的酚/ 氯仿/异戊醇混合物（混合物中三者比例依次为 25:24:1），颠倒混匀 15 s，静置 5 min 后，在 4 ℃条 件下 12 000 r/min 离心 15 min。 3.5.1.4 重复 3.5.1.3 步骤 1 次。 3.5.1.5 吸取离心后各管中的上清液转移至相应的管中，加入 1/10 体积的 3 mol/L 的醋酸钠溶液（pH 值为 5.2）、2.5 倍体积的无水乙醇，颠倒混匀 15 s，-20 ℃沉淀 2 h。 3.5.1.6 于 4 ℃条件下，13 000 r/min 离心 15 min。轻轻倾去上清液，加入 800 μL 75%乙醇清洗 沉淀 2 次，2 000 r/min 离心 15 s，用无菌枪头吸尽残余液体，室温静置 5 min。 3.5.1.7 加入 50 μL 灭菌去离子水重悬，轻轻混匀溶解管壁上的 DNA，冰上保存备用。提取的 DNA 应 在 2 h 内进行 PCR 扩增或保存于-20 ℃冰箱，将核酸转移至反应混合物配制区。 3.5.2 商品化试剂盒 DNA 提取方法 也可采用市售商品化的DNA提取试剂盒，完成样品中病毒DNA的提取。 3.6 对照 分别以鸭圆环病毒、鹅圆环病毒DNA样品作为阳性对照。以番鸭细小病毒或其他病毒（如鸭瘟病毒、 产蛋综合征病毒等）DNA样品作为阴性对照。以上对照样品均由指定单位提供。 3.7 3.7.1 2 PCR 反应 常规 PCR 反应操作 DB35/T 1822—2019 3.7.1.1 PCR 反应液配置为：每个反应管的 PCR 反应体系为 25 μL，依次加入 17.75 μL 灭菌去离子 水，2.5 μL Taq 聚合酶 10×缓冲液，0.5 μL dNTPs （2.5 mmol/L each），0.5 μL Taq DNA 聚合 酶（1 U/μL），引物 CVF 0.75 μL（10 mmol/L），引物 DuCVR 和 GoCVR 各 0.5 μL（10 mmol/L）， 样品 DNA 2 μL，0.5 μL MgSO4（50 mmol/L）。 3.7.1.2 PCR 反应步骤：混匀后 2 000 r/min 离心 15 s，使反应混合液都沉降到 PCR 管底。将上述混 合物按照以下步骤进行 PCR：95 ℃预热 5 min 后，按以下循环参数循环：94 ℃、30 s，53 ℃、30 s， 72 ℃、1 min，循环 35 次；72 ℃延伸 8 min，反应结束后保存于 10 ℃。 3.7.2 商品化试剂盒 PCR 反应操作 也可采用市售商品化的常规PCR试剂盒，并按试剂盒的操作说明完成。 3.8 PCR 产物电泳 反应结束后，分别取待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品和空白对照样品各5 μL PCR产物 与0.5 μL 10×加样缓冲液混合均匀，加入到1.0%琼脂糖凝胶板的样孔中，同时在另一样孔中加5 μL DNA 作为标准分子量对照；以5 V/cm的电场强度进行电泳，30 min后经紫外凝胶成像系统观察结果。 3.9 测序 使用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现407 bp或554 bp大小的 扩增条带，应对其切胶回收后进行测序，也可直接送PCR产物进行测序，鹅圆环病毒参考序列参见附录B 的B.1，鸭圆环病毒参考序列参见附录B的B.2。 3.10 3.10.1 结果判定 实验成立条件 当阳性对照样品中，鹅圆环病毒样品出现407 bp大小的扩增条带（参见附录C中图C.1的2号泳道）， 鸭圆环病毒样品出现554 bp大小的扩增条带（参见附录C中图C.1的3号泳道），阳性样品混合物出现 407 bp和554 bp大小的扩增条带（参见附录C中图C.1的4号泳道），空白对照样品和阴性对照样品均无 特异性扩增条带（参见附录C中图C.1的1号、5号泳道），本次实验结果有效。 3.10.2 待检样品结果判定 3.10.2.1 当待检样品出现 407 bp 左右特异性条带（参见附录 C 中图 C.1 的 8 号泳道），所获扩增产 物与参考序列（参见附录 B 的 B.1）或 GenBank 数据库中水禽圆环病毒基因序列同源性达到 90%以上， 可判样品为 GoCV 核酸阳性； 3.10.2.2 当待检样品出现 554 bp 左右特异性条带（参见附录 C 中图 C.1