ICS 11.220 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/ T 2921—2018 禽白血病 A/B/J 亚群检测 PCR 法 Detection method of PCR of avian leukosis A, B and J-subgroups 2018 - 11 - 12 发布 吉林省市场监督管理厅 2018 - 12 - 30 实施 发 布 DB22/T 2921—2018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。 本标准主要起草人：曹利利、郭衍冰、董航、姚新华、苑淑贤、程荣华、邵洪泽。 I DB22/T 2921—2018 禽白血病 A/B/J 亚群检测 PCR 法 1 范围 本标准规定了禽白血病A/B/J亚群PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于禽白血病A/B/J亚群的核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 试剂或材料 3.1 试剂 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 3.1.8 3.1.9 3.1.10 3.1.11 3.1.12 3.2 材料 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.3 病毒基因组 DNA 提取试剂盒。 阳性对照，为禽白血病病毒基因组 DNA，或含有上述片段的质粒标准分子 DNA。 阴性对照，健康鸡血液或血清 DNA。 10×PCR 缓冲液，见附录 A.1。 10 mmol/L dNTPs。 2 U/μL Taq DNA 聚合酶。 水为 DEPC 处理过的双重蒸馏水（ddH2O），符合 GB/T 6682 的规定。 50×TAE 电泳缓冲液，见附录 A.2。 10 mg/mL 溴化乙锭（EB）溶液，见附录 A.3 或其他同类型可替代物。 1.0 %琼脂糖凝胶，见附录 A.4。 上样缓冲液，见附录 A.5。 标准分子量 DL 2000 Marker。 10 μL、200 μL 和 1 000 μL 吸头。 1.5 mL 离心管。 无菌棉拭子。 0.2 mL 薄壁 PCR 管。 引物 引物序列、浓度及扩增长度见表 1。 1 DB22/T 2921—2018 表1 引物 上游引物 引物序列及浓度 引物序列 F 5′- GCCAAACGGATTTCTGCCTT -3′ AR 5′- AACCCAGATACCAAGGAACC -3′ 使用浓度 扩增长度 375 bp 10 μmol/L 下游引物 4 BR 5′- ACAGATGGACCAATTCTGTCTC -3′ 581 bp JR 5′- ATTGTTCCACAACACCTCTG -3′ 683 bp 仪器设备 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 5 微量移液器，2.5 μL、20 μL、200 μL、1 000 μL。 电子天平，感量 0.1 mg。 均质器。 低温高速离心机。 PCR 扩增仪。 核酸电泳仪。 紫外凝胶成像仪。 样品 5.1 血液或血清样品的处理 用移液器（4.1）吸取抗凝血液或血清样品 500 μL（3.2.1）于1.5 mL的离心管（3.2.2）中，以病 毒基因组DNA提取试剂盒（3.1.1）提取样本DNA，操作方法按说明书进行。 5.2 鸡胚尿囊液的处理 用移液器吸取鸡胚尿囊液 500 μL于1.5 mL 的离心管中，以病毒基因组 DNA 提取试剂盒提取样本 DNA，操作方法按说明书进行。 5.3 肿瘤或其他组织的处理 称取（4.2）100 mg 肝脏、脾脏或胰腺等组织用均质器（4.3）研碎，以病毒基因组DNA提取试剂盒 提取样本DNA，操作方法按说明书进行。 5.4 喉拭子和泄殖腔拭子的处理 将喉拭子和/或泄殖腔拭子（3.2.3）置于1.5 mL离心管中，以少量ddH2O浸润，用离心机（4.4）3 000 r/min 离心 15 min，取上清液 500 μL于 1.5 mL 离心管中，以病毒基因组DNA提取试剂盒提取样本 DNA， 操作方法按说明书进行。 2 DB22/T 2921—2018 6 试验步骤 6.1 PCR 扩增 分别设立以ddH2O为模板的空白对照、阳性对照（3.1.2）、阴性对照（3.1.3）和待检样品，采用 50 μL反应体系，在0.2 mL薄壁 PCR 管（3.2.4）中依次加入表 2 所示的试剂后，瞬时离心混匀，做好 标记，于PCR仪（4.5）中扩增。 表2 PCR 反应体系 成分 用量 10×PCR 缓冲液（3.1.4） 5 μL dNTPs（3.1.5） 4 μL Taq DNA聚合酶（3.1.6） 1 μL 引物F（3.3） 4 μL 引物AR（3.3） 2 μL 引物BR（3.3） 2 μL 引物JR（3.3） 2 μL 模板（5） 4 μL ddH2O（3.1.7） 26 μL PCR反应条件为 94 ℃ 预变性 5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min， 35 个循环，72 ℃ 延伸 10 min，4 ℃ 保存。 6.2 电泳 6.2.1 将适量 50×TAE（3.1.8）稀释成 1×TAE 溶液，配制溴化乙锭（3.1.9）含量为 0.5 μg/mL 的 1.0 %琼脂糖凝胶（3.1.10），见附录 A.4。 6.2.2 取 8 μL PCR 产物，与 2 μL 上样缓冲液（3.1.11）混匀，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。 6.2.3 加入标准分子量 DL 2000 Marker（3.1.12）。 6.2.4 设置电泳仪（4.6）电压为 5 V/cm，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定。 6.2.5 用紫外凝胶成像仪（4.7）观察结果。 7 结果判定 7.1 当 ALV-A、ALV-B 及 ALV-J 阳性对照分别出现 375 bp、581 bp 及 683 bp 扩增带，而空白对照和 阴性对照未出现目的带时，实验结果成立。 7.2 当被检样品出现 375 bp、581 bp 或 683 bp 扩增带，则分别判定为 ALV-A、ALV-B 或 ALV-J 亚群 阳性，参见附录 B，未出现相应扩增带的样品判为阴性。 3 DB22/T 2921—2018 AA 附 录 A （资料性附录） 相关试剂配制 A.1 10×PCR缓冲液 10×PCR缓冲液配制见表 A.1。 表A.1 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.8） 10.0 mL 1 mol/L KC1 50.0 mL Nonidet P40 8.0 mL 1.5 mol/L MgCl2 1.0 mL ddH2O 加至1 000.0 mL A.2 50×TAE 电泳缓冲液制备 A.2.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液配制（pH 8.0）见表A.2。 表A.2 二水乙二铵四乙酸二钠 18.6 g ddH2O 80.0 mL 氢氧化钠（1 mol/L NaOH） 调pH至 8.0 ddH2O 加至 100.0 mL A.2.2 50×TAE电泳缓冲液配制见表 A.3。 表A.3 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 242.0 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0） 100.0 mL ddH2O 加至 1 000.0 mL 作电泳液使用时，用ddH2O进行 50 倍稀释 A.3 溴化乙锭（EB）溶液配制 溴化乙锭（EB）溶液见表 A.4。 4 DB22/T 2921—2018 表A.4 溴化乙锭 0.2 g ddH2O 加至 20.0 mL A.4 1.0 %琼脂糖凝胶板制备 1.0 %琼脂糖凝胶板制备见表A.5。 表A.5 琼脂糖 1.0 g 50×TAE 电泳缓冲液 2.0 mL ddH2O 98.0 mL 微波炉中完全融化，待冷却至 50 ℃  60 ℃ 时，加溴化乙锭（EB）溶液 5 μL 后摇匀，倒入电泳板中，凝 固后取下梳子，备用。 A.5 上样缓冲液 上样缓冲液见表A.6。 表A.6 溴酚蓝 0.2 g 蔗糖 50.0 g ddH2O 100 mL 溴酚蓝 0.2 g，加 10 mL ddH2O 溶解过夜。 50 g 蔗糖加入 50 mL ddH2O 溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中， 摇匀定容至 100 mL。 5 DB22/T 2921—2018 B B A.5 附 录 B （资料性附录） 阳性对照 PCR 扩增结果 A亚群标准阳性PCR扩增结果见图 B.1。 图B.1 B亚群标准阳性PCR扩增结果见图 B.2。 图B.2 6 DB22/T 2921—2018 J亚群标准阳性PCR扩增结果见图 B.3。 图B.3 A、B、J亚群标准阳性PCR扩增结果见图 B.4。 图B.4 _________________________________ 7