ICS 11.220 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/ T 2922—2018 鸡传染性支气管炎病毒检测 荧光 RT-PCR 法 Detection of chicken infectious bronchitis virus Real-time PCR method 2018 - 11 - 12 发布 吉林省市场监督管理厅 2018 - 12 - 30 实施 发 布 DB22/T 2922—2018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：呼延含蓉、程荣华、柴方红、张淑莹、王楠、于钦磊、高春生、吴丹、孙亮、 马晓媛、卢松岩、付瑶、王建超、陆伟、何浩、傅国群。 I DB22/T 2922—2018 鸡传染性支气管炎病毒检测 荧光 RT-PCR 法 1 范围 本标准规定了鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR检测方法的材料、操作步骤和结果判定。 本标准适用于鸡传染性支气管炎的诊断、监测及流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 材料 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.2.6 3.2.7 3.3 仪器设备 干热灭菌箱。 高压蒸汽灭菌器。160 ℃ 。 冰箱，2 ℃～8 ℃，-20 ℃和-80 ℃三种。 恒温水浴锅，控温范围为室温至 100 ℃。 可调移液器，最大量程为 10 μL，200 μL，1000 μL。 高速冷冻离心机，12 000r/min 以上。 荧光定量 PCR 扩增仪。 器械与耗材 医用棉签。 医用剪刀，16 cm。 医用镊子，16 cm。 1.5 mL 离心管，15 mL 离心管，50 mL 离心管。 组织匀浆器或研钵。 吸头，10 μL，20 0μL，1000 μL。 荧光 PCR 管。 试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 3.3.1 0.02 mmol/L PBS，见附录 A。 3.3.2 RNA 提取试剂盒。 3.3.3 荧光 RT-PCR 反应液。 3.3.4 灭菌双蒸水。 1 DB22/T 2922—2018 3.3.5 3.4 阳性对照，鸡传染性支气管炎病毒 S1 基因序列片段，见附录 B。 引物和探针 3.4.1 引物和探针序列见表 1。 表1 名称 序列 上游引物 F 5'- ATC CTT TTA TTA ATA GTA -3' 下游引物 R 5'- TAG TTT CTA GTC TAA AAT TAC -3' 探针 P 5'- CAA ACA CAA ACA GCT CAG AGT -3' 3.4.2 4 引物和探针序列 引物和探针均用灭菌双蒸水稀释成 10 μmol/L，-20 ℃ 保存备用。 操作步骤 4.1 采样器具前处理 4.1.1 组织匀浆器或研钵（3.2.5）、医用剪刀（3.2.2）、镊子（3.2.3）经 160 ℃ 干热（3.1.1） 灭菌 2 h。 4.1.2 1.5 mL 离心管（3.2.4）经 121 ℃ ± 2 ℃ 高压蒸汽（3.1.2）灭菌 15 min。 4.2 样品的采集、贮运和保存 4.2.1 棉拭子样品的采集 将医用棉签（3.2.1）深入喉头上腭及上腭裂来回刮 3 次～ 5 次，使其蘸有咽喉分泌液，然后将 咽喉拭子放入盛有 1.0 mL PBS（3.3.1）的离心管中，编号备用。 4.2.2 组织样品的采集 采集鸡气管的下 1/3 段和肺脏，置于无菌离心管（15 mL 或 50 mL）。 4.2.3 样品的贮运 样品采集后应置于加冰袋的保温箱中、密封，24 h 内送至实验室进行处理，超过 24 h 应冷冻保 存。 4.3 4.3.1 样品的处理 棉拭子的处理 将装有棉拭子的离心管反复震荡离心，3000 r/min 离心 15 min，取上清液待检。 4.3.2 组织样品的处理 将组织样品按 1:10 比例加入PBS，用组织匀浆器或研钵研磨匀浆，3000 r/min 离心 15 min，取 上清液待检。 4.4 2 RNA 提取 DB22/T 2922—2018 按照 RNA 提取试剂盒（3.3.2）说明书要求操作提取待检样品的 RNA，提取的RNA应迅速进行荧光 定量 RT-PCR 扩增。若需长期保存应放置 -80 ℃ 冰箱。 4.5 反应体系 4.5.1 荧光 RT-PCR 扩增反应体系见表 2。 表2 荧光 RT-PCR 反应体系 试剂 剂量 上游引物 F(10 μmol/L) 0.8 μL 下游引物 R(10 μmol/L) 0.8 μL 探针 P(10 μmol/L) 0.5 μL 荧光RT-PCR反应液 10 μL 灭菌双蒸水 5.9 μL 待检样品 RNA 2.0 μL 总体积 20.0 μL 4.5.2 4.6 以灭菌双蒸水为阴性对照，以鸡传染性支气管炎病毒 S1 基因序列片段为阳性对照（3.3.5）。 反应程序 4.6.1 荧光 RT-PCR 反应程序见表 3。 表3 荧光 RT-PCR 反应程序 反应步骤 温度 时间 循环数次 第一步 42 ℃ 30 min 1 第二步 95 ℃ 2 min 1 95 ℃ 15 s 60 ℃（在此收集荧光） 1 min 第三步 4.6.2 5 40 将 PCR 反应管置荧光 PCR 仪（3.1.7）扩增，选择 FAM 通道。 结果判定 5.1 结果分析条件设定 试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct 值为每个反应管内的荧光信 号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最 高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。 5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3 质控标准 阴性对照无 Ct 值并且无典型扩增曲线。 阳性对照的 Ct 值应≤35.0，并出现特定的扩增曲线。 如阴性对照和阳性对照不满足以上所有条件，检测结果视为无效。 3 DB22/T 2922—2018 5.3 结果描述及判定 5.3.1 无 Ct 值，无典型的扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为鸡传染性支气管炎病毒核酸阴 性。 5.3.2 Ct 值≤ 35.0，出现典型的扩增曲线，判为鸡传染性支气管炎病毒核酸阳性。 5.3.3 35.0 ＜ Ct 值 ≤ 40.0，出现特定的扩增曲线，样品判为疑似。应重新采样检测，结果仍为疑 似，判定为鸡传染性支气管炎病毒核酸阳性。 4 DB22/T 2922—2018 AA 附 录 A （规范性附录） 磷酸盐缓冲生理盐水 A.1 A液 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液，称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）71.64 g，先加适量去离子水溶解， 最后定容至 1000 mL，混匀。 A.2 B液 0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液，称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）31.21 g，先加适量去离子水溶解， 最后定容至 1000 mL，混匀。 A.3 0.02mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）的配制 量取 0.2 mol/L的A液 360 mL，0.2 mo1/L 的B液140mL，称取氯化钠 38 g，用去离子水溶解稀释 至 5000 mL，4 ℃ 保存。 5 DB22/T 2922—2018 BB 附 录 B （规范性附录） S1 基因序列片段 S1基因序列片段。 tccttttattaa tagtagttta gttaagcaga agtttattgt ctatcgtgaa aatagtgtta atactacttt tacgttacac aatttcactt ttcataatga gactggcgcc aaccctaatc ctagtggtgt tcagaatatt caaacttacc aaacacaaac agctcagagt ggttattata attttaattt ttcctttctg agtagttttg tttataagga gtctaatttt atgtatggat cttatcaccc aagttgtaat tttagactag aaact _________________________________ 6