ICS 11.220 B 41 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1852—2019 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 Detection methods of real-time RT-PCR for Porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2019 - 09 - 11 发布 福建省市场监督管理局 2019 - 12 - 11 实施 发 布 福 建 省 地 方 标 准 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 DB35/T 1852—2019 * 2019 年 9 月第一版 2019 年 9 月第一次印刷 DB35/T 1852—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 缩略语 ............................................................................ 1 4 疾病概述 .......................................................................... 1 5 实验室诊断 ........................................................................ 2 6 综合判定 .......................................................................... 4 附录 A（规范性附录） 试剂的配制 ...................................................... 5 附录 B（资料性附录） 扩增产物参考基因序列 ............................................ 6 I DB35/T 1852—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由福州海关提出并归口。 本标准起草单位：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心、深圳市易瑞生物技术有限公司、厦门 瑞德利校准检测技术有限公司、东莞市中鼎检测技术有限公司、深圳市中鼎检测技术有限公司。 本标准主要起草人：郑腾、张体银、朱海、杨荣淇、付辉、张险朋、柯丽群、张志灯、林杰、 林季敏、王武军、唐寰宇、张婷、白泉阳。 II DB35/T 1852—2019 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的流行病病学调查、监测和诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：循环阈值（Cycle Threshold） DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethy Pyrocarbonate） PRRS：猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome） PRRSV：猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus） RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid） RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction） 4 疾病概述 4.1 病原 PRRS是PRRSV引起的猪的一种高度传染性疾病，又称“猪蓝耳病”。PRRSV为动脉炎病毒属的成员， 是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子呈球型，直径为55 nm～60 nm。病毒有2个血清型，即美洲 型和欧洲型，我国分离到的毒株为美洲型。病毒对酸、碱都较敏感，尤其很不耐碱，一般的消毒剂对其 都有作用，但在空气中可以保持3周左右的感染力。 4.2 流行病学 PRRSV可感染各种品种、不同年龄和用途的猪，以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感。患病猪和带 毒猪是本病的重要传染源。主要传播途径是接触感染、空气传播，也可通过胎盘垂直传播。持续性感染 是PRRSV流行病学的重要特征。PRRSV可在感染猪体内存在很长时间。猪在感染病毒后2～14周均可通过 接触将病毒传播给其它易感猪。 1 DB35/T 1852—2019 4.3 临床诊断 妊娠后3个月的母猪如果感染PRRSV，则会表现流产、早产、胎儿自溶和木乃伊等典型特征。出生前 后感染PRRSV的新生仔猪，呼吸困难、急促，同时出现眼周及眼睑水肿，结膜炎，蓝耳，食欲不振，发 热，皮肤红斑，腹泻，震颤，毛发粗乱，厌食和神经症状。断乳仔猪感染PRRSV的典型临床症状表现为 发热、肺炎、昏睡及精神萎靡，如果伴发细菌感染，则死亡率显著升高。 5 实验室诊断 5.1 设备、材料和试剂 5.1.1 设备 5.1.1.1 5.1.1.2 5.1.1.3 5.1.1.4 台式冷冻高速离心机（转速至少达到 12 000 r/min 以上）。 微量可调移液器（100 µL～1 000 µL、20 µL～200 µL、2 µL～20 µL、0.5 µL～10 µL）。 冰箱（2 ℃～8 ℃和-20 ℃）。 荧光定量 PCR 仪。 5.1.2 材料和试剂 5.1.2.1 试验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格要求。 5.1.2.2 焦炭酸二乙酯处理水（DEPC 水）。 5.1.2.3 Trizol。 5.1.2.4 三氯甲烷。 5.1.2.5 异丙醇。 5.1.2.6 无水乙醇。 5.1.2.7 2×Taq PCR Master Mix。 5.1.2.8 荧光 RT-PCR 检测用引物和探针序列为： a) PRRSV-F 5’-CACTACGGTCAACGGCACATT-3’； b) PRRSV-R 5’-GCATATTTGACAAGGTTTACCACTCC-3’； c) PRRSV-P FAM-CTTTTCTGCCACCCAACACGAGGCTT-MGB。 扩增片段约99 bp，用水溶解至10 μmol/L后，保存于-20 ℃备用。 5.1.2.9 质控物质：阳性对照为含 PRRSV 基因目的片段的质粒 DNA；阴性对照为不含 PRRSV 基因的质 粒 DNA 或含非 PRRSV 基因的质粒 DNA；DEPC 水为空白对照。 5.2 样品的采集、处理、存放和运输 5.2.1 样品采集和前处理过程的注意事项 采样及样品前处理过程过程中样品不得交叉污染，应戴一次性手套、口罩和帽子，采样工具使用前 先消毒处理。 2 DB35/T 1852—2019 5.2.2 样品的采集和前处理 5.2.2.1 棉拭子样品 采样时将棉拭子探入鼻腔来回刮取3～5次，取鼻腔分泌物；将棉拭子探入肛门旋转并沾取粪便；将 鼻腔拭子和肛门拭子一起放入盛有1.0 mL拭子悬液（符合附录A中A.1的规定）的无菌Eppendorf管中， 4 ℃下5 000 r/min离心10 min，取上清液备用。 5.2.2.2 组织样品 采集有明显病变的淋巴结、扁桃体、肺、脾、肾、胸腺等组织样品，无菌取0.5 g样品研磨后，加 0.3 mL～0.5 mL的组织悬液（符合附录A中A.2的规定）进行匀浆混匀，转入无菌Eppendorf管中， 4 ℃下5 000 r/min离心10 min，取上清液备用。 5.2.2.3 血清样品 取耳静脉或前腔静脉血3 mL～5 mL，待析出血清后，直接吸取血清备用。 5.3 病毒 RNA 的提取 在实验室操作过程中首先应严格遵守GB 19489的要求。分别取200 μL待检样品，加入1 mL Trizol 试剂，用移液器充分吹打10～20次，室温放置5 min；加入200 μL三氯甲烷，旋涡振荡30 s混匀，室温 放置15 min；4 ℃下12 000 r/min离心15 min；取上层水相加入等体积异丙醇，上下颠倒数次混匀， -20 ℃放置20 min；4 ℃下12 000 r/min离心15 min；弃上清液，沉淀用1 mL75％乙醇清洗；10 000 r/min 离心10 min，弃上清液，沉淀室温干燥5 min；加20 μL DEPC水溶解RNA沉淀。-20 ℃冰箱保存备用， RNA溶液应避免反复冻融，并尽快用于检测。空白对照、阴性对照和阳性对照进行同步操作。 RNA提取也可采用等效的商品化RNA提取试剂盒。 5.4 实时荧光 RT-PCR 扩增 5.4.1 反应体系 在0.2 mL PCR反应管中分别加入如下试剂：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL；10 μmol/L的正向 引物、反向引物和探针各0.5 μL；模板RNA 5 μL，随后加DEPC水至总体积25 μL，混匀，瞬时离心5 s。 5.4.2 反应程序 将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，扩增反应条件设定：50 ℃逆转录15 min；94 ℃预变性3 min； 之后94 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共40个循环；后4 ℃保温。同时设立阳性、阴性对照和空白对照。 5.4.3 结果判定 综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚好超 过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择FAM通道进行分析。 阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值≤30；阴性对照和空白对照无扩增曲线，而且Ct值＞40 或未检出，二者均成立才可判定试验成立。 检验样本Ct值≤35时，报告为猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性。 检验样本35＜Ct值≤40时，重复一次，如果Ct值仍然≤40，并且曲线有明显的对数增长期，报告为 猪繁殖与呼吸综合