ICS 65.020.30 B41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3085—2017 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经 典毒株的 RT-PCR 鉴别检测技术 Identification of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain and classical strain by RT-PCR 2017 - 12 - 29 发布 山东省质量技术监督局 2018 - 01 - 29 实施 发 布 DB37/T 3085—2017 前 言 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：杜以军、齐静、丛晓燕、陈蕾、孙文博、陈智、郭立辉、于江、吴家强、李俊、 时建立。 I DB37/T 3085—2017 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的 RT-PCR 鉴别 检测技术 1 范围 本标准规定了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴别检测技术的操作要求。 本标准适用于高致病性及经典猪繁殖与呼吸综合征的实验室诊断、监测和流行病学调查等。 2 实验室生物安全要求 实验室必须为生物安全Ⅱ级（BSL-2级）及以上实验室。 3 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 4 术语与定义 下列术语与定义适用于本标准。 4.1 PCR 聚合酶链式反应。 4.2 SDS 十二烷基硫酸钠。 5 仪器设备和试剂 5.1 仪器设备 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 微量移液器（最大量程分别为 10μL、20μL、100μL、1000μL），带滤芯的枪头。 20000r/min 低温高速离心机。 电热恒温水槽。 稳流稳压电泳仪。 水平电泳槽。 1 DB37/T 3085—2017 5.1.6 5.1.7 5.1.8 5.1.9 5.1.10 5.1.11 5.1.12 5.1.13 5.1.14 凝胶成像系统。 紫外透射反射分析仪。 电磁炉。 烧杯（1000 mL）。 电子天平 精度为：0.001 g。 PCR 扩增仪。 组织匀浆器或研钵。 -20 ℃冰柜。 2 ℃～8 ℃冰箱。 5.2 试剂 除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。 5.2.1 Trizol。 5.2.2 氯仿。 5.2.3 75%乙醇。 5.2.4 异丙醇。 5.2.5 AMV 反转录酶（200 U/μL）。 5.2.6 RNA 酶抑制剂（40 U/μL）。 5.2.7 Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）。 5.2.8 1.0 %琼脂糖凝胶：见附录 A.1。 5.2.9 50×TAE 缓冲液：见附录 A.2.1 和 A.2.2。 5.2.10 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌双蒸水：见附录 A.3。 5.2.11 DNA 分子量标准 DL2000。 5.2.12 超纯水：符合 GB/T 6682，三级。 5.2.13 引物： 上游引物P1:5-AAAGAYCAGATGGAGGAG-3； 下游引物P2:5-TRATGGCTTGAGCTGAG-3；斜体代表兼并碱基； 经典毒株扩增片段长度大小为766 bp，高致病性毒株扩增基因片段大小为676 bp。 6 操作程序 6.1 样品的采集和处理 6.1.1 样品的采集 临床上猪的脾、肺、淋巴结、血液等，置于-20 ℃冰柜或液氮中保存。 6.1.2 样品的处理 6.1.2.1 取猪的脾、肺、淋巴结等组织约 5 g 于研钵中，用剪刀剪碎，加入 2 mL PBS 缓冲液，研磨； 血液 3000 r/min 离心 5 min，分离血清。 6.1.2.2 阳性对照处理：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的疫苗株和经典毒株的疫苗株。 6.1.2.3 阴性对照处理：灭菌双蒸水。 6.2 RNA 的提取–Trizol 法 2 DB37/T 3085—2017 6.2.1 向处理好的 300 μL 组织样品或血清中加入 800 μL Trizol，重复吹打以裂解细胞（或者剧烈 振荡），冰上放置 10 min～25 min。 6.2.2 加入氯仿 200 μL，用力振荡 30 s，室温放置 5 min。 6.2.3 4 ℃，12000 r/min 离心 15 min，吸取上层液体 500 μL 于 1.5 mL EP 管中。 6.2.4 加入 1.0 mL 异丙醇，-20 ℃沉淀 RNA 至少 1 h。 6.2.5 4 ℃ 12000 r/min 离心 10 min，弃上清，用 75 %的乙醇洗涤沉淀，12000 r/min 离心 5 min， 彻底弃去上清，自然条件下干燥沉淀，溶于 50 μL DEPC 处理的灭菌双蒸水中，-20 ℃贮存，备用。也 可选择市售商品化 RNA 提取试剂盒，完成 RNA 的提取。 6.2.6 试验中同时设立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的疫苗株和经典毒株的疫苗株作为阳性对 照和灭菌双蒸水作为阴性对照。 6.3 反转录 表1 反转录 20 μL 体系 序号 体系组成 体系含量 1 RNA 5 μL 2 2.5 mmol/L 反转录引物（下游引物） 1 μL 3 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL 70 ℃保温5 min，冰浴2 min。继续加入。 表2 反转录体系 序号 体系组成 体系含量 1 5×反转录酶反应缓冲液 4 μL 2 AMV 反转录酶 0.8 μL 3 RNA 酶抑制剂 0.5 μL 4 灭菌 DEPC 水 6.7 μL 瞬时离心后，42 ℃处理45 min，95 ℃灭活10 min。取出后直接进行PCR，或置于-20 ℃保存备用。 6.4 PCR PCR为50 μL体系，按表3中1～7的循序配制。 表3 PCR 为 50 μL 体系 序号 体系组成 体系含量 1 灭菌双蒸水 37.5 μL 2 反转录产物 4 μL 3 10 mmol/L上游引物 0.5 μL 4 10 mmol/L下游引物 0.5 μL 5 10×PCR Buffer 5 μL 6 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL 7 Taq DNA聚合酶 0.5 μL 3 DB37/T 3085—2017 首先加入灭菌双蒸水，然后按顺序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混悬， 瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。循环参数为95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min， 循环30次，72 ℃延伸10 min结束。 也可选择市售商品化RT-PCR试剂盒，完成反转录聚合酶链式反应。 6.5 琼脂糖凝胶电泳 6.5.1 6.5.2 6.5.3 6.5.4 6.5.5 6.5.6 制备 1.0 %琼脂糖凝胶板，见附录 A.1。 取 5 μL PCR 产物与 0.5 μL 加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。 加入分子量标准。 盖好电泳仪，插好电极，5 V/cm 电压电泳，30 min～40 min。 用凝胶成像仪观察、扫描图片存档。 用分子量标准比较判断 PCR 片段大小。 7 结果判定 7.1 在阳性对照出现 766 bp 或者 676 bp 扩增带、阴性对照无此扩增带时，实验结果成立（参见附录 A.4）。 7.2 被检样品扩增片段长度大小为 766 bp 则判定为经典猪繁殖与呼吸综合征病毒株，扩增基因片段大 小为 676 bp 则判定为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株（参见附录 A.5）。 4 DB37/T 3085—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 1.0 %琼脂糖凝胶的配制 表A.1 1.0 %琼脂糖凝胶的配制 试剂名称 用量 琼脂糖 1.0 g 0.5×TAE电泳缓冲液 加至100 mL 微波炉中完全融化，待冷至50 ℃～60 ℃时，加溴化乙锭（EB）溶液5 μL，摇匀，倒入电泳板上， 凝固后取下梳子，备用。 A.2 50×TAE电泳缓冲液 A.2.1 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0） 表A.2 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液 试剂名称 用量 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调 pH 至 8.0 灭菌双蒸水 加至 100 mL A.2.2 TAE电泳缓冲液（50×）配制 表A.3 TAE 电泳缓冲液（50×）配制 试剂名称 用量 三羟基甲基氨基甲烷（Tris） 242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（PH8.0） 100 mL 灭菌双蒸水 加至 1000 mL 用灭菌双蒸水稀释使用。 A.3 DEPC水 表A.4 DEPC 水的配制 试剂名称 用量 灭菌双蒸水 100 mL DEPC 100 μL 室温过夜，121 ℃高压15 min，分装到1.5 mL DEPC处理过的微量管中。 5 DB37/T 3085—2017 A.4 对照试验 图A.1 对照试验 RT-PCR 结果 1：DNA Marker DL2000；2：阴性对照扩增条带；3：高致病性PRRSV毒株阳性对照RT-PCR扩增条带； 4：经典PRRSV毒株阳性对照RT-PCR扩增条带。 A.5 检测样品 图A.2 检测样品 RT-PCR 结果 1：DNA Marker DL2000；2：阴性样品扩增条带；3,6：高致病性PRRSV毒株阳性样品RT-PCR扩增条 带；4,5：经典PRRSV毒株阳性样品RT-PCR扩增条带。 _________________________________ 6