(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210709452.1 (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 郑州大学 地址 450000 河南省郑州市高新 技术开发 区科学大道100号 申请人 河南省农业科 学院园艺研究所 　 河南开元农业发展 有限公司 (72)发明人 位芳　田昭然　谢正清　申笑菡　 刘玥　师恭曜　曹刚强　田保明　 魏小春　褚立金　 (74)专利代理 机构 西安汇智创想知识产权代理 有限公司 61247 专利代理师 张亚玲 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01)C12Q 1/6811(2018.01) C12Q 1/6841(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 25/20(2019.01) G06K 9/62(2022.01) (54)发明名称 一种识别白菜型油菜染色体的寡核苷酸探 针套设计及应用 (57)摘要 本发明涉及细胞学技术领域， 更具体而言， 一种识别白菜型油菜染色体的寡核苷酸探针套 设计及应用。 包括以下步骤： S1： 获取白菜型油菜 R‑o‑18参考基因组中NR ‑TR集合； S2： 对NR ‑TR集 合进行统计聚类并得到其白菜型油菜染色体TR 阵列数据； S3： 获取在白菜型油菜所有染色体均 富集的重复序列簇； S4： 将得到的重复序列簇的 重复序列代表阵列进行分割； S5： 将分割后序列 分别使用b  l astn比对到白菜型油菜R ‑o‑18参 考基因组， 得到覆盖白菜 型油菜10条 染色体的寡 核苷酸探针套。 本发明利用白菜型油菜R ‑o‑18参 考基因组序列信息， 通过生物信息学方法分析串 联重复序列， 设计了白菜型油菜染色体的寡核苷 酸探针套， 建立了涂染白菜型油菜染色体的技 术， 该技术能够批量涂染白菜型油菜染色体材 料。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 115029474 A 2022.09.09 CN 115029474 A 1.一种识别白菜型油菜染色体的寡核苷酸探针套设计， 其特 征在于： 包括以下步骤： S1： 获取白菜型油菜R ‑o‑18参考基因组中的重复单元大于300bp串联重复序列TR， 并对 其获取结果去冗余， 得到非冗余TR阵列NR ‑TR集合； S2： 对所述 NR‑TR集合进行统计聚类并得到白菜型油菜染色体的TR阵列数据； S3： 检测所述步骤S2得到的TR阵列序列的同源拷贝在白菜型油菜R ‑o‑18参考基因组中 的分布情况， 得到在白菜型油菜所有染色体均富 集的重复序列簇； S4： 将所述步骤S3得到的重复序列簇的重复序列代表阵列从头开始切割为长40bp， 步 长为5bp的寡核苷酸序列； S5： 将分割后序列分别使用blastn比对到白菜型油菜R ‑o‑18参考基因组， 其参数为 pident＝90， qcovhsp＝90， 得到覆盖白菜型油菜10条染色体的寡核苷酸探针套。 2.根据权利要求1所述的一种识别白菜型油菜染色体的寡核苷酸探针套设计,其特征 在于： 所述 步骤S5得到的寡核苷酸探针套为FAM荧 光标记的oPA4和oPA10， 具体序列为： oPA4:FAM‑5'‑ACTTTATGTATC CAAATCAAGCTTCTCACATCGCGAT TCA‑3'； oPA10:FAM‑5'‑TTGGAACGACGAAGAAGCTGTCCTATTCCCAAACTGGGAA‑3'。 3.根据权利要求1或2所述的一种识别白菜型油菜染色体的寡核苷酸探针套的方法,其 特征在于： 包括以下步骤： S1变性杂交染液配制： 将寡核苷酸探针套干粉用超纯水溶解为1μg/μL的浓度； 每张制 片滴加上述白菜 型油菜染色体寡核苷 酸探针套溶液各0.5 μL、 50％去离子甲酰胺15 μL、 20％ 硫酸葡聚糖6 μL、 10％2 ×SSC溶液3 μL， ddH2O 5 μL， 共30 μL， 于99℃下变性10min， 迅速转入冰 水混合物中并放入 ‑20℃冰箱内10mi n。 S2杂交： 将S1中配制好的染液滴到白菜型油菜花药减 Ⅰ中期染色体制片上， 每张制片滴 加变性杂交液3 0 μL， 盖上盖玻片， 置 于80℃烘片机上变性3mi n， 37℃杂交6 h。 S3染色： 轻磕掉盖玻片， 于2 ×SSC中洗涤3次， 每次5min， 最后ddH20流水冲洗一遍， 黑暗 条件下烘干， 每张制片滴加20μL抗荧光淬灭封片剂配制的5％DAPI染液， 加盖玻片， 染色 10min， 镜检、 拍照。 4.根据权利要求3所述的一种白菜型油菜染色体的寡核苷酸探针套设计方法及应用, 其特征在于： 所述2 ×SSC缓冲液由0.3 M的柠檬酸 三钠C6H5Na3O7·2H2O和3M的NaCl组成。 5.一种如权利要求2所述的 的寡核苷酸探针套在鉴定白菜型油菜染色体中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029474 A 2一种识别白菜型油菜染色体的寡核 苷酸探针套设计及应用 技术领域 [0001]本发明涉及细胞学技术领域， 更具体而言， 一种识别白菜型油菜染色体的寡核苷 酸探针套设计及应用。 背景技术 [0002]白菜型油菜(Brassica  rapa)是重要的经济作物， 是三大主要油菜类型之一， 也是 “禹氏三角 ”的基础组成之一(A基因组)。 寡核苷酸荧光原位杂交技术是一种以单链寡核苷 酸为探针的新型荧光原位杂交技术， 这些寡核苷酸探针是一种新型 的染色体物理标记， 可 从已测序 物种的基因组中开 发。 以白菜型油菜的参考基因组中鉴定的重复序列设计的探针 进行基因组荧光原 位杂交可以有效识别芸薹属A基因组， 可以实现对白菜型油菜A基因组材 料和变异体的鉴定， 对野生种与白菜型油菜基因组亲缘关系的鉴定， 以及对异源多倍体材 料中芸薹属A亚基因组的鉴定， 可用于白菜型油菜育种材料创制和遗传研究， 具有重要意 义。 传统的白菜型油菜探针开发是利用BAC测序得到的重复序列， 实验复杂繁琐。 发明内容 [0003]为了解决上述技术问题， 本发明提供识别白菜型油菜 染色体的寡核苷酸探针套设 计方法及应用， 本发明能够批量涂染白菜型油菜染色体材 料。 [0004]为解决上述 技术问题， 本发明采用的技 术方案为： [0005]一种识别白菜型油菜染色体的寡核苷酸探针套设计， 包括以下步骤： [0006]S1： 获取白菜型油菜R ‑o‑18参考基因组中的重复单元大于300bp串联重复序列TR， 并对其获取 结果去冗余， 得到非冗余TR阵列NR ‑TR集合； [0007]S2： 对所述 NR‑TR集合进行统计聚类并得到白菜型油菜染色体的TR阵列数据； [0008]S3： 检测所述步骤S2得到的TR阵列序列的同源拷贝在白菜型油菜R ‑o‑18 参考基 因组中的分布情况， 得到在白菜型油菜所有染色体均富 集的重复序列簇； [0009]S4： 将所述步骤S3得到的重复序列簇的重复序列代表阵列从头开始切割为长 40bp， 步长为5bp的寡核苷酸序列； [0010]S5： 将分割后序列分别使用blastn比对到白菜型油菜R ‑o‑18参考基因组， 其参数 为pident＝90， qcovhsp＝90， 得到覆盖白菜型油菜10条染色体的寡核苷酸探针套。 [0011]优选的， 所述步骤S5得到的寡核苷酸探针套为FAM荧光标记的oPA4和oPA10， 具体序 列为： [0012]oPA4:FAM‑5'‑ACTTTATGTATC CAAATCAAGCTTCTCACATCGCGAT TCA‑3'； [0013]oPA10:FAM‑5'‑TTGGAACGACGAAGAAGCTGTCCTATTCCCAAACTGGGAA‑3'。 [0014]一种识别白菜型油菜染色体的寡核苷酸探针套的应用,包括以下步骤： [0015]S1变性杂交染液配制： 将寡核苷酸探针套干粉用超纯水溶解为1 μg/ μL  的浓度； 每 张制片滴加上述白菜型油菜染色体寡核苷酸探针套溶液各0.5 μL、  50％去离子甲酰胺15 μ L、 20％硫酸葡聚糖6 μL、 10％2 ×SSC溶液3 μL， ddH2O 5 μL， 共30 μL， 于99℃下变性10min， 迅速说　明　书 1/4 页 3 CN 115029474 A 3