(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210647423.7 (22)申请日 2022.06.09 (71)申请人 广州血康陆道培生物技 术有限公司 地址 510700 广东省广州市黄埔区崖鹰石 路10号B415 (72)发明人 胡斌　王军　刘刚　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 赵崇杨 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测白血病患者中M-bcr基因型的 试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测白血病患者中 M‑bcr基因型的试剂盒。 所述试剂盒包含一对检 测引物和一条检测探针， 本发明通过在检测探针 特定的碱基位置采用锁核酸标记 技术， 将探针长 度控制在15～18bp， 比常规探针长度短30％左 右， 在提高灵敏度的同时特异性也得到显著提 升， 其检测灵敏度 达到1×101copies/mL， 能完全 满足临床的低拷贝模板的检测， 在病程早期表达 量低时即可实现对BCR ‑ABL1融合基因M ‑bcr基因 型的检测， 满足白血病患者临床诊断和预后判断 需求。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 115198004 A 2022.10.18 CN 115198004 A 1.一种用于检测白血病患者中M ‑bcr基因型的引物 组， 其特征在于， 包含如下所示的检 测引物对和检测探针： 上游引物F： 5 ’ ‑ctcgtgtgtg aaactccagac‑3’， 下游引物R： 5 ’ ‑actgggtccagcgagaaggtt‑3’； 探针： 5’ ‑gGctCtaTg gGtttCtg‑3’， 其5端’标记荧光基团， 3 ’标记淬灭基团。 2.根据权利要求1所述引物组， 其特 征在于， 所述 荧光基团为Cy5、 H EX、 VIC或FAM 。 3.根据权利要求1所述引物组， 其特 征在于， 所述淬灭基团为BHQ ‑1、 Cy3或TAMRA。 4.权利要求1～3任一所述引物组在检测白血病患者中M ‑bcr基因型或在制备检测白血 病患者中M ‑bcr基因型的试剂盒中的应用。 5.一种检测白血病患者中M ‑bcr基因型的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1.提取白血病患者的RNA； S2.将步骤S1的RNA反转录成cDNA模板或直接以步骤S1的RNA为模板， 利用权利要求1～ 3任一所述引物组进行一 步法荧光定量PCR扩增反应； S3.结果判定： 通过扩增曲线进行判定， 若扩增曲线呈明显单一S型曲线， 则患者中存在 M‑bcr基因型， 若扩增曲线不 为单一S型曲线， 则患者中不存在M ‑bcr基因型。 6.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 所述一步法荧光定量PCR扩增体系为20μM引 物0.8μL， 20μM探针0.4μL， 5 ×一步法RT ‑PCR缓冲液5μL， 热启动酶2U， MMLV酶100U， dNTPs   25mM 0.6 μL。 7.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 所述一步法荧光定量PCR扩增程序为50℃ 15min； 95℃10mi n； 95℃15sec， 58℃45sec， 45个 循环。 8.一种检测白血病患者中M ‑bcr基因型的试剂盒， 其特征在于， 包含权利要求1～3任一 所述引物组。 9.根据权利要求8所述试剂盒， 其特征在于， 还包含PCR反应液、 PCR反应酶系、 M ‑bcr基 因型阳性质控品以及阴性质控品。 10.权利要求8或9所述试剂盒在检测白血病患者中M ‑bcr基因型中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115198004 A 2一种用于 检测白血病患者中M ‑bcr基因型的试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及医学检测技术领域， 更具体地， 涉及一种检测白血病患者中M ‑bcr基因 型(BCR‑ABL1融合基因P210亚型)的试剂盒。 背景技术 [0002]白血病(Leukemia)， 亦称作血癌， 是一种造血系统的恶性肿瘤 。 病源是由于细胞内 脱氧核糖核酸的变异形成的骨髓中造血组织的不正常工作。 骨髓中的干细胞每天可以制造 成千上万的红血球和白细胞。 白血病病人过分生产不成熟的 白细胞， 妨害骨髓的其他工作， 这使得骨髓生产其它 血细胞的功能 降低。 白血病可以扩散到淋巴结、 脾、 肝、 中枢神经系统 和其它器官。 白血病居年轻人恶性疾病中的首位。 白血病有多种类型， 临床上， 一般分急性 白血病和慢 性白血病。 包括 急性淋巴细胞性白血病(ALL)， 急性骨髓性白血病(AML)， 慢 性淋 巴细胞性白血病(CLL)， 慢性骨髓细胞性白血病(CML)， 年轻型骨髓单核细胞性白血病 (JML)， 成人T细胞淋巴性白血病(ATL)。 成年人中最常见的是急性骨髓性白血病和慢 性骨髓 细胞性白血病， 儿童中比较常见的是急性淋巴细胞性白血病。 [0003]慢性粒细胞白血病(chronic  myeloid leukemia， CML)， 即慢性骨髓细胞性 白血 病， 是首个被识别的与特定染色体或基因相关的肿瘤性疾病， 其标志性特征为费城染色体 (Ph染色体)， 即9号和22号染色体异位t(9； 22)(q34； q11)， 致病基础为位九号染色体长臂上 的上的原癌基因ABL(位置q34)与二十二号染色体上长臂的BCR基因(位置q11)发生并列性 易位而产生一种 新的融合基因， 即BCR ‑ABL1融合基因。 该融合基因存在于95％以上的慢性 粒细胞白血病(CML)、 25％ ‑30％的成人和2 ％‑5％的儿童急性白血病(ALL)， 以及少数急性 髓细胞性白血病(AML)、 骨髓增生异常综合征(MDS)等血液系统肿瘤患者中。 BCR ‑ABL1融合 基因是一种抗细胞凋亡 的基因， 具有高度酪氨酸激酶活性， 可激活多种信号传导途径使细 胞过度增殖进而导致细胞调控发生紊乱， 干扰细胞 的正常增殖和凋 亡程序， 导致白血病的 发生。 [0004]根据BCR基因的断裂位点不同， BCR基因与ABL1基因产生3种不同BCR ‑ABL1融合基 因的异构体， 分别为主要型(major  bcr， M‑bcr)即e13a2(原b2a2)或e14a2(原b3a2)， 编码 P210胞浆蛋白， 见于90％以上的CML患者和部分Ph 染色体阳性的ALL患者(Ph+‑ALL)中； 次要 型(minor  bcr， m‑bcr)即e1a2编码P190融合蛋白， 绝大部分Ph+ALL患者为该型别； 微小型 ( μ‑bcr)即e6a2， e8a2或e19a2等， 编码P230融合蛋白， 见于2 ‑3％的CML患者。 其中， 主要型与 次要型占95％以上。 因此对BCR ‑ABL1融合基因的分型检测有助于了解疾病的表型， 检测白 血病患者中BCR ‑ABL1融合基因是诊断CML的最特异最敏感生物方法之。 同时目前对CML患者 的治疗已从传统的姑息性治疗、 化疗发展到使用特异的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine   kinase in‑hibitors， TKI)进行分子靶向治疗。 经过TKI治疗后可以达到完全的细胞遗传学 的缓解(cytogenetic  remission， CCR)， 即Ph阳性的细胞消失， 患者体内可能只存在微小残 留病灶。 临床上可通过定期监测患者的BCR ‑ABL1融合基因转录水平来评估酪氨 酸激酶抑制 剂(TKI)的疗效及微小残留情况， 从而更好的指导患者分子靶向治疗和预后判断。说　明　书 1/6 页 3 CN 115198004 A 3