(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210748649.6 (22)申请日 2022.06.29 (71)申请人 上海交通大 学 地址 200240 上海市闵行区东川路80 0号 (72)发明人 张勇　高雪纯　陈润莎　刘慧侠　 吴金鸿　延泉德　 (74)专利代理 机构 上海汉声知识产权代理有限 公司 3123 6 专利代理师 胡晶 (51)Int.Cl. C12N 9/10(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种热与有机溶剂稳定性提高的糖基转移 酶突变体 (57)摘要 本发明提供了一种热与有机溶剂综合稳定 性提高的糖基转移酶突变体。 本发 明基于酶结构 解析及蛋白稳定性计算辅助设计， 将糖基转移酶 UGT109A3野生型基因序列编码的氨基酸置换 Ser203Cys、 Asn304Trp、 Ala45Leu、 Cys127Tyr， Thr229Ile得到糖基转移酶UGT109A3m(S203C/ N304W)双位点及UGT109A3m(A45 L/C127Y/T229I) 三位点突变体， 其中所获得的最优突变体的热稳 定性Tm值提高了7.1℃， 且在50％(v/v)DMSO反应 体系中， 相对催化活性由60％提升到91％,这一 结果提升了糖基转移酶的实际应用价 值。 权利要求书1页 说明书6页 序列表7页 附图2页 CN 114875007 A 2022.08.09 CN 114875007 A 1.一种热与有机溶剂稳定性提高的糖基转移酶突变体， 其特征在于， 所述糖基转移酶 突变体由糖基转移酶UGT109 A3氨基酸序列进行点 突变得到； 所述糖基转移酶突变体包括： Ser203Cys/Asn304Trp双点突变体或Ala45Leu/ Cys127Tyr/Thr 229Ile三点突变体。 2.根据权利要求1所述的热与有机溶剂稳定性提高的糖基转移酶突变体， 其特征在于， 所述Ser203Cys/Asn304Trp双点突变体的氨基酸序列为SEQ  ID No.1所示， 所述Ala45Leu/ Cys127Tyr/Thr 229Ile三点突变体的氨基酸序列如SEQ  ID No.2所示。 3.根据权利要求1所述的热与有机溶剂稳定性提高的糖基转移酶突变体， 其特征在于， 所述糖基转移酶突变体还包括与SEQ  ID No.1或No.2所示氨基酸序列的同源性≥85％或≥ 90％， 并具有糖 基转移酶活性的衍 生蛋白。 4.根据权利要求1所述的热与有机溶剂稳定性提高的糖基转移酶突变体， 其特征在于， 所述糖基转移酶突变 体的表达载体为pET系列载体。 5.根据权利要求1所述的热与有机溶剂稳定性提高的糖基转移酶突变体， 其特征在于， 所述糖基转移酶突变 体的表达载体是糖 基转移酶突变 体的原核或真核表达载体。 6.根据权利要求4或5所述的热与有机溶剂稳定性提高的糖基转移酶突变体， 其特征在 于， 所述表达载体用于转 化的微生物宿主细胞为大肠杆菌或酵母表达系统。 7.根据权利要求1所述的热与有机溶剂稳定性提高的糖基转移酶突变体， 其特征在于， 所述Ser203Cys/Asn304Trp双点突变体的核苷酸序列为SEQ  ID No.3所示， 所述Ala45Leu/ Cys127Tyr/Thr 229Ile三点突变体的核苷酸序列为SEQ  ID No.4所示。 8.一种糖基转移酶突变体基因， 其特征在于， 所述基因的核苷酸序列为： 如SEQ  ID  No.3或SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。 9.一种用于构建糖基转移酶突变体的引物对， 其特征在于， 所述引物对包括针对S203C 的如SEQ ID： No.6、 SEQ  ID： No.7所示的引物对1， 针对 N304W的如SEQ  ID： No.8、 SEQ  ID： No.9 所示的引物对2； 以及针对A45L的如SEQ  ID： No.10、 SEQ  ID： No.11所示的引物对3， 针对 C127Y的如SEQ  ID： No.12、 SEQ  ID： No.13 所示的引物对 4， 针对T229I的如SEQ  ID： No.14、 SEQ   ID： No.15所示的引物对5 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114875007 A 2一种热与有机溶剂稳定性提高的糖基转移酶突变体 技术领域 [0001]本发明涉及基因工程领域， 具体地， 涉及一种热与有机溶剂稳定性提高的糖基转 移酶突变 体。 背景技术 [0002]天然糖苷类化合物是创新药物的重要来源。 糖基化对天然产物的药效、 生物利用 度和作用机制等产生重要影响,糖基转移酶介导的糖基化修饰是天然产 物糖基化的重要 策 略。 UGT糖基转移酶是专门负责催化这种糖基化反应的酶,它将活性核苷糖， 如从尿嘧啶核 苷二磷酸‑葡萄糖(UDP ‑glucose)， 的糖基转移到激素、 代谢产物、 病原菌侵染物以及植物内 外源毒性物质等一系列小分子化合物受体上。 一些UGT糖基转移酶催化反应同时也具有杂 泛性,即不仅能识别结构多样的底物(糖基受体和供体),而且还能催化形成不同的糖苷键 以及具有反应的可逆性等,是多样性 天然产物糖苷类衍生物制备与活性分子新药发现的有 效手段。 糖基化会改变小分子化合物的生物活性、 水溶性、 稳定性、 在细胞内运输特性、 亚细 胞定位以及与受体的相互识别与结合特性,另外还能降低/除去内源和外源物质的毒性。 [0003]作为一种天然的生物催化剂， UGT糖基转移酶往往具有催化效率高、 底物选择性和 杂泛性高等优点， 在工业生产中具有巨大 的应用潜力。 在工业生产过程中较高的反应温度 能够增加底物的溶解性， 降低反应过程中被微生物污染的概率， 同时较高的温度也能提高 反应的速率。 然而目前大多数的UGT糖基转移酶来 自植物、 常温微生物， 通常只能在较为温 和的条件 下发挥催 化作用， 导致酶在广泛的实际应用中存在局限性。 因此， 对酶进 行定向设 计以提高其综合稳定性， 拓展其实际应用是十分必要的。 [0004]野生型UGT109A3是一种分离于Bacillus  subtilis， 具较优高催化活性及 受体底 物杂泛性的甾体糖基转移酶。 在三萜皂苷类活性天然产物的化学酶法合成中具有应用潜 力。 然而UGT109A3糖基转移酶作为一种常温酶， 其天然蛋白的热稳定及化学稳定性有限， 制 约了其工业 化实际应用。 发明内容 [0005]针对现有技术中的缺陷， 本发明的目的是提供一种本发明提供了热稳定及化学稳 定性提高的糖基转移酶突变体， 由糖基转移酶UGT109A3进行点突变， 获得稳定性提升的糖 基转移酶突变体， 亲本糖基转移酶UGT109A3氨基酸序列在氨基酸取代位置发生突变， 采用 “原始氨基酸/位置/替换氨基酸 ”来表示糖基转移酶突变体的氨基酸， 所述的糖基转移酶突 变体为Ser203Cys/Asn304Trp双点点突变体及Ala45Leu/Cys127Tyr/Thr229Ile三点突变 体。 [0006]本发明的目的是通过以下 方案实现的： [0007]本发明的第一方面提供一种热与有机溶剂 稳定性提高的糖基转移酶突变体， 所述 糖基转移酶突变 体由糖基转移酶UGT109 A3氨基酸序列进行点 突变得到； [0008]所述点突变为糖基转移酶U GT109A3氨基酸序列在氨基酸取代位置 发生突变， 采用说　明　书 1/6 页 3 CN 114875007 A 3