(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211045735.7 (22)申请日 2022.08.30 (71)申请人 军事科学院军事医学研究院军 事兽 医研究所 地址 130122 吉林省长 春市净月区柳莺西 路666号 (72)发明人 万家余　李忠义　郝镯　刘文森　 董明鑫　 (74)专利代理 机构 辽宁鸿文知识产权代理有限 公司 21102 专利代理师 王海波 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一 种 基 于 点 击 化 学 末 端 转 移 酶 及 CRISPRCas12a对miRNA的检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于点击化学末端转移 酶及CRISPRCas12a对miRNA的检测方法。 首先， 靶 标miRNA‑21作为模板， 将两个核 酸探针进行点击 化学连接， 其生成物可与磁珠(MBs)结合。 然后用 TdT对其连接的核 酸探针和互补 链miRNA‑21进行 延伸。 延伸出的poly ‑T尾巴激活了CRISPR/ Cas12a的反式切割能力， 从而切割报告基因来产 生荧光信号。 microRNAs(miRNAs)检测的特异性 和灵敏性在癌症的早期诊断和各种疾病的治疗 中起着至关重要的作用。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 115418392 A 2022.12.02 CN 115418392 A 1.一种基于点击化学末端转移 酶及CRISPRCas12a对miRNA的检测方法， 其特征在于： 将 含有miRNA互补片段被连接的DNA链通过链霉亲和素 ‑生物素相互作用附着在磁珠(MBs)表 面， MBs通过磁分离被 保留； 在dTTP和TdT存在的情况下， 连接的DNA链和互补链miRNA暴露的 游离3'‑OH端可以产生连续的poly ‑T； crRNA的识别区域包含一个21bp的poly ‑A尾巴； 扩展 的poly‑T尾巴可以作为激活剂， 补充crRNA， 激活CRISPR/Cas12a的反式切割， 切割报告基 因， 产生荧光信号。 2.根据权利要求1所述的一种基于点击化学末端转移酶及CRISPRCas12a对miRNA的检 测方法， 其特 征在于以下步骤： 步骤1： 制备crRNA (1)将2 μL  crRNA模板和2 μL  T7启动子(100μM)混合在14μL无酶水中； 将混合物在95℃ 下孵育5min， 然后逐渐冷却至25℃， 放置2h； (2)将10 μL  100mM dNTP缓冲液和2 μL  T7 RNA聚合酶混合； 在37℃下转录16h， 进而转录 出大量的靶crRNA； (3)用DNaseI在37℃下 降解crRNA模板15min； 然后使用RNA清除试剂盒纯化已获得的 crRNA， 并在无DNase/rNase的水中重新溶解； (4)使用NanoDrop  1000(Waltham， MA， USA)测量crRNA的浓度， 并在使用前保存在 ‑80 ℃； 步骤2： miRNA的检测 (1)将不同浓度的miRNA ‑21混合到含有2 μL探针A和2 μL探针B(各0.5 μM， 表S1)30 μL的反 应体系缓冲液中； 在37℃孵育30min后， 加入3μL  MBs， 再37℃孵育30min， 用50μL  PBS溶液 (pH 7.6)通过磁铁 重复磁分离冲洗 3次， 保留MBs； (2)向反应中加入2.5 μL  2.5mM氯化钴、 2.5 μL  10×TdT缓冲液、 2 μL  10mM dTTP、 2U TdT 和10 μL无酶水在37℃孵育40min； 将反应体系在80℃下加热10min， 以灭活TdT的催化活性； 10 μL反应溶液包含2 μL  0.8 μM Cas12a,2 μL  5×缓冲溶液和1μL  1.5 μM crRNA， 在25℃预孵 化10min， 添加2μL的反应产物和1μL  10μM HEX； cas12a催化的HEX裂解反应在37℃下保持 1h； 荧光信 号在激发波长为495nm， 发射波长为556nm下采用ND ‑3300荧光光谱仪测量， 进而 用于检测miRNA ‑21； 步骤3： 凝胶电泳分析 将上述反应产物 10 μL和6×上样缓冲液(2 μL)预混； 将每种混合物(10 μL)注射到聚丙烯 酰胺凝胶电泳(PAGE)系统中， 凝胶在1 ×TBE缓冲液(89mM硼酸， 89mM  Tris和2.0mM  EDTA， pH  8.2)中运行； 电泳在180V下电泳45min， 用10 ×SYBR GreenII染色20min； 使用Azure生物系 统C600对凝胶进行 可视化。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115418392 A 2一种基于点 击化学末端转移酶及 CRISPRCas12a对miRNA的检 测方法 技术领域 [0001]本发明属于生物检测技术领域， 涉及一种基于点击化学末端脱氧核苷酸转移酶结 合CRISPR/Cas12a对miRNA的检测方法。 背景技术 [0002]MiRNA是一类具有高保守、 小分子量(18 ‑25nt)的非编码内源性单链RNA， 广泛存在 于人类遗传基因组中。 一些mi RNAs与多种疾病密切相关， 如精神疾病、 心血管疾病和肿瘤的 发生。 MiRNAs可以与特定的靶基因结合， 调控下游靶基因的转录和翻译， 并在各种疾病中发 挥不同的作用。 例如， miRNA ‑21作为一种致癌基因， 可能成为各种疾病和癌症诊断的生物标 志物和治疗靶点。 许多传统的miRNAs检测策略(RNA印迹、 微阵列、 实时定量PCR)已经得到了 广泛的应用。 RNA印迹是一种常用的miRNAs检测方法， 但该方法通量低， 灵敏度低， 使用时间 长， 消耗大量样品。 微阵列技术对多种miRNAs的高通量分析尤其有效， 但 其灵敏度和选择性 较低。 与上述两种方法相比， 实时荧光定量PCR(qRT ‑PCR)具有较高的灵敏度、 准确性和实用 性， 是目前基因定量表达的金 标准。 该方法往往存在分析复杂、 成本高、 通 量低的问题。 [0003]聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)为分子诊断建 立了新的途径。 CRISPR/Cas12任意切割非目标核酸(称为反式核酸活性)后， 其已经显示出 作为一种生物传感器的巨大潜力。 由于CRISPR/Cas12a系统具有固有的高分辨率、 简单性和 自我信号放大能力， 因此为miRNA检测方法提供了新的机会。 许多基于CRISPR/Cas12a的生 物传感器与交链反应(HCR)、 催化 发夹组装(CHA)、 滚动循环转录(RCT)和链置换扩增等核酸 等温扩增技术相结合去提高miRNAs检测的灵敏度。 HCR电路作为一个信号传感器， 将每个 miRNA转化为多个可编程的DNA双链， 激活CRISPR/Cas12a的反式裂解活性。 基于CRISPR/ Cas12a结合HCR开发了一种简单、 通用的miRNA检测 平台。 利用模块化CHA将靶miRNA转化并 扩增为多个可编程DNA双链， 启动CRISPR/Cas12a的反式切割能力。 通过将CRISPR/Cas12a和 CHA电路结合， 建立了一种用于miRNAs扩增检测的通用传感系统。 靶miRNA特异性地启动 CHA， 然后激活被阻断的crRNA变为前体crRNA进行CRISPR/Cas12a加工， 从而产生成熟地 crRNA引导CRISP R/Cas12a识别激活剂和解锁CRISPR/C as12a的反式裂解能力 。 Chen等人通 过将基于RNA的CHA电路与CRISPR/Cas12a集成， 建立了一步miRNA检测 平台。 陈等人通过将 基于RNA的CHA电路与CRISP R/Cas12a集成， 建立了一步miRNA检测平台。 RCT被miRNA特异性 启动生成长的单链RNA， 导致产生大量CRISPR/Cas12a前体crRNA重复序列， 用于自身crRNA 修剪和组建， 进一步激活其反式切割活性。 基于RCT结合CRISPR/Cas12a， 建立了miRNA检测 的生物传感器。 “入侵堆叠引物 ”扩增反应作为链置换扩增反应， 将 每个miRNA转化为大量的 DNA， 触发CRISPR/Cas12a的反式裂解核酸酶活性。 李等人制作了一个通过 “入侵堆叠引物 ” 扩增反应和CRISPR/Cas12a检测miRNA的即时检测平台。 李等人引入级 联脚趾介导的链置换 反应(CTSD R)并结合CRISP R/Cas12a反式裂解用于miRNA检测。 在本研究中， 将靶miRNA与合 理设计的探针杂交后启动动态CTSDR， 导致无酶靶点循环和产生多个可编程DNA双链， 触发说　明　书 1/7 页 3 CN 115418392 A 3