(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211108067.8 (22)申请日 2022.09.09 (71)申请人 邹政 地址 200000 上海市宝山区同泰北路101号 (72)发明人 邹政　吴炯　施美芳　 (74)专利代理 机构 苏州简专知识产权代理事务 所(普通合伙) 3240 6 专利代理师 李正方 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种前列腺癌PCA3分数检测的试剂盒及方 法 (57)摘要 本发明公开了一种前列腺癌PCA3分数检测 的试剂盒及方法， 包括引物、 探针、 荧光定量反应 预混液、 阳性对照与空白对照， 使用商 业化RNA保 存液保存样品， TRIzol法提取样品的RNA， 以提取 样品的RNA为模板， 将RNA逆 转录为cDNA， 用PCA 3‑ F、 PCA3‑R、 探针、 PSA内参基因引物PSA ‑F、 PSA‑R 以及PSA内参基因探针PSA ‑FAM‑P进行定量PCR扩 增反应获得扩增产物， 对扩增产物进行扩增曲线 分析， 得到基因的Ct值， 并代入公式得到PCA3分 数=2^[Ct(PS A)‑Ct(PCA3)] ×100， 若PCA3分数若 大于31说明PCA 3基因上调表 达， 若PCA 3分数若低 于31说明PCA 3基因下调表 达； 若PCA 3分数若等于 31说明PCA 3基因正常表达。 本发明所述的一种前 列腺癌PCA 3分数检测的试剂盒及方法， 进 一步提 高前列腺癌PCA 3基因检测试剂盒的稳定性、 灵敏 度、 准确度等 性能。 权利要求书2页 说明书10页 附图1页 CN 115404276 A 2022.11.29 CN 115404276 A 1.一种前列腺癌PCA3分数检测的试剂盒， 包括引物、 探针、 荧光定量反应预混液、 阳性 对照与空白对照， 其特 征在于： 所述引物核苷酸序列如下 所示： PCA3‑F： 5'‑GGTGGGAAGGACCTGATGATAC ‑3'； PCA3‑R： 5'‑GGGCGAGGCTCATCGAT ‑3'； 所述探针的核苷酸序列如下 所示： PCA3‑FAM‑P： 5'‑AGAAATGCCCGGCCGCCATC‑3'。 2.根据权利要求1所述的一种前列腺癌PCA3分数检测的试剂 盒， 其特征在于： 所述探针 5'标记的荧光基团为FAM、 VIC、 TEXAS  RED中的至少一种， 探针3'标记的淬灭基团为TAMRA、 BHQ中的至少一种。 3.一种前列腺癌PCA3分数检测的方法， 其特 征在于： 包括以下操作步骤： S1： 使用商业 化RNA保存液保存样品； S2： TRIzo l法提取样品的RNA； S3： 以提取样品的RNA为模板， 将RNA逆转录为cDNA； S4： 用PCA3 ‑F、 PCA3‑R、 探针、 PSA内参基因引物PSA ‑F、 PSA‑R以及PSA内参基 因探针PSA ‑ FAM‑P进行定量PCR扩增反应获得扩增产物； S5： 对扩增产物进行扩增曲线分析， 得到基因的Ct值， 并代入公式得到PCA3分数=2^[Ct (PSA)‑Ct(PCA3)] ×100； S6： 若PCA3分数若大于31说明PCA3基因上调表达， 若PCA3分数若低于31说明  PCA3基因 下调表达； 若PCA3分数若等于 31说明PCA3基因正常表达 。 4.根据权利 要求3所述的一种前列腺癌PCA3分数检测的方法， 其特征在于： 所述S1步骤 中样本采集的具体方案和操作为： A1： 选取男性前列腺癌患者 （实验组） 和男性非前列腺癌患者 （对照组， 镜下白细 胞>10） 的尿液， 每 个收集10mL； A2： 3500rpm离心10mi n后收集细胞/沉渣， 弃去上清； A3： 将细胞/沉渣等用PBS洗涤一次， 离心后弃去上清； A4： 再用少量的PBS重悬， 然后加入2倍体积 （~1mL） 的RNA  followAll保存溶液， 装入2mL 离心管中； A5： 在4℃环境下 可保存和运输1个月。 5.根据权利 要求3所述的一种前列腺癌PCA3分数检测的方法， 其特征在于： 所述S2步骤 中RNA提取的具体操作为： B1： 用冰冷的PBS轻 轻漂洗细胞 单层 （两次） ； B2： 加入1mL  TRIZOL裂解细胞为均质样品， 室温孵 育5min； B3： 反复吸打， 收集到RNase  free tube中； B4： 加入20 0ul的氯仿， Votex  15s； B5： 室温孵 育3min； B6： 4℃120 00g转15mi n （可适当延长） ； B7： 吸取上层液500ul加入一个新的tube中； B8： 加入5 00ul的异丙醇 混匀； B9： 孵育10min在室温4℃  12000g离心10mi n；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115404276 A 2B10： 吸走 上清液， 加入1ml  75%乙醇洗一下 （Votex  10s） ； B11： 4℃ 7500g离心5mi n， 弃去酒精； B12： 重复洗一下， 尽可能吸干净， 后37℃放置 30min让酒精和水挥发干净， 晾干RNA； B13： DEPC水20ul （细胞房分装DEPC水） （测浓度尽可能使浓度集中在500 ‑1000ng/ul） ， 反复吸打或Votex  10s或37℃孵 育10min,溶解沉淀块，‑80℃保存。 6.根据权利 要求3所述的一种前列腺癌PCA3分数检测的方法， 其特征在于： 所述S3步骤 中逆转录的具体操作为： C1： 配制逆转录体系 （在冰上进行） ； C2： 轻柔混匀后进行逆转录反应， 条件如下： 37℃  15min， 85℃ 5sec， 4℃。 7.根据权利 要求3所述的一种前列腺癌PCA3分数检测的方法， 其特征在于： 所述S4步骤 中PSA内参基因引物核苷酸序列为： P SA‑F： AGAAGCATTCCCAACCCTGG； PSA‑R： GCAAGATCACGCT TTTGTTCCT。 8.根据权利 要求3所述的一种前列腺癌PCA3分数检测的方法， 其特征在于： 所述S4步骤 中用2xTaq  PCR Mix产品， 以逆转录的cDNA为模板扩增， 反应体系为25 μL， 反应结束后， 取5 μ L反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115404276 A 3