(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210729616.7 (22)申请日 2022.06.24 (71)申请人 广州市碳码科技有限责任公司 地址 510000 广东省广州市广州高新 技术 产业开发区科学城南云二路62 号自编 一栋新华汇A楼二层201房 (72)发明人 方志远　陈国强　罗微　周丹　 邓裕华　杜岗　 (74)专利代理 机构 广州专理知识产权代理事务 所(普通合伙) 44493 专利代理师 张凤 (51)Int.Cl. C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种barcode微 滴的单细胞测序方法 (57)摘要 本发明属于单细胞测序方法的技术领域， 具 体涉及一种barcode微滴的单细胞测序方法， 其 为基于纳米和微米尺寸的bar code微滴用于单细 胞及亚细胞结构的单细胞测序， 适合于全长mRNA 测序及随机引物法 mRNA测序。 权利要求书2页 说明书5页 附图4页 CN 115058503 A 2022.09.16 CN 115058503 A 1.一种barcode微 滴的单细胞测序方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 1)barcode微 滴制备及特 征 1.1)建立barcode微 滴 将barcode微滴分为多个大的液滴库进行建库， 利用微流控芯片系统分离微滴， 包括 barcode库1、 barcode库2、 barcode库3， …， 以此类推； 1.2)微滴制备分离时分别从混合库1以及其后的n个库中分别取1个液滴， n≥1， 将取出 的多个液滴与扩增mix混合形成一个扩增液滴； 扩增后最后对产物进行破乳， 收集cDNA并进行建库， 进行测序和分析； 2)对全长mRNA以及引物mRNA进行建库测序： 将包含多个片段的Barcode用于标记细 胞， 以及一个与Barcode 连接的UMI 来标记转录 本； 3)利用转座酶法或者随机引物法扩增cDNA得到双链DNA文库， 并采用Illumina高通量 测序系统进行测序。 2.根据权利要求1所述的barcode微滴的单细胞测序方法， 其特征在于， 步骤1)所述 barcode库1包括10 0个细分， 为barcode1 ‑1， barcode1 ‑2， ....， barcode1 ‑100； 所述barco de1‑1制备出10n个液滴， 其中n＞1， 每个液滴含有不低于106根barcode1 ‑1， 同理制备 100个细分bar code“1‑n”的液滴库barcode 1‑1‑barcode1‑100， 并混合成为液滴库 barcode库1， 含有10n+2个液滴； 同理， 制备其 他barcode “N‑n”液滴库N。 3.根据权利要求1所述的barcode微滴的单细胞测序方法， 其特征在于， 步骤2)所述 Barcode为2 ～6段的序列组成。 4.根据权利要求3所述的barcode微滴的单细胞测序方法， 其特征在于， 所述Barcode为 多段的序列组成， 分别为上游Barcode以及下游， 若为多端Barcode， 则中间Barcode含有 linker序列， 该通过linker序列经过PCR将附近的Barco de进行连接， 以3段为例， 分别为上 游Barcode、 中间Barcode和下游Barcode。 5.根据权利要求4所述的barcode微滴的单细胞测序方法， 其特征在于， 所述上游 Barcode的3 ’端为3‑5个G， 用于RAC E反转录， 5 ’端为adapter序列， 用于连接测序接 头； 上游Barcode的序列为： 5' ‑adapter+j jjjjj+GGG‑3’； 所述j为细胞 标记核酸序列cel l lable。 6.根据权利要求4所述的barcode微滴的单细胞测序方法， 其特征在于， 以3个Barcode 为例， 所述中间Barcode的3 ’端为polyT序列， 用于mRNA的反转录， 5 ’端为linker； 中间Barcode的序列为： 3' ‑polyT+jjjjjj+linker‑5’； 所述j为cel l lable。 7.根据权利要求4所述的barcode微滴的单细胞测序方法， 其特征在于， 所述下游 Barcode3 ’端为anti ‑linker， 与上一个中间Barcode的linker互补， 中间为cell  lable， 5’ 端为UMI序列； 下游Barcode的序列为： 5' ‑nnnnnnnnnnnnnn++jjjjjj+anti‑linker‑3’； 所述n为UMI。 8.根据权利要求7所述的barcode微滴的单细胞测序方法， 其特征在于， 所述UMI由4～ 10个核苷 酸随机排列组成， 在mRNA反转录后， 进入到文库中， 每一个 mRNA随机连上一个UMI， 因此可以计数不同的UMI， 最终 实现mRNA的计数。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115058503 A 29.根据权利要求1所述的barcode微滴的单细胞测序方法， 其特征在于， 步骤2)所述 Barcode由多个随机碱基构成， 其组合方式为4n， 根据测序深度决定其序列的长短n， 多个 Barcode的组合编码一个细胞， 以3个Barcode为例， 组合数为Barcode1 ×Barcode2 × Barcode3＝ 4n×4n×4n， 其组合数一般不低于106以满足最低单细胞测序深度需求。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115058503 A 3