(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210967527.6 (22)申请日 2022.08.12 (71)申请人 杭州圣域生物医药 科技有限公司 地址 310000 浙江省杭州市余杭区仓前街 道仓兴街1390号 4幢101-1、 201-1室 (72)发明人 吴朵　施松　贺虎　刘颂　 (74)专利代理 机构 杭州中利知识产权代理事务 所(普通合伙) 33301 专利代理师 韩洪 (51)Int.Cl. C12N 15/85(2006.01) C12N 15/65(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01)A61K 31/7056(2006.01) A61K 31/706(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物 的筛选方法及应用 (57)摘要 本发明公开了一种靶向抑制RNA聚合酶I的 小分子化合物的筛选方法， 依次包括以下步骤： a)FBL全长ORF基因克隆； b)将FBL全长ORF基因连 接pEGFP‑C1载体得到重组质粒； c)重组质粒测序 验证获取正确质粒； d)正确质粒转染HeLa细胞； e)筛选出能稳定表 达EGFP‑FBL蛋白的HeLa细胞； f)判断EGFP ‑FBL是否聚集， 否则转入g步骤， 是则 转入h步骤； g)提示该小分子不造成核仁应激， 不 予考虑， 然后结束； h)验证45S  pre‑rRNA水平是 否降低， 且不影响GAPDH  mRNA转录， 是则转入 i步 骤， 否则结束； i)筛选出有效抑制RNA聚合酶I的 小分子化合物， 提示为Pol  Ii， 然后结束。 本发明 具有操作 简单、 可进行高通量筛选， 荧光定量PCR 方法检测灵敏度高、 特异性强， 筛选 出的RNA聚合 酶I小分子抑制剂有望进一步开发成为新型、 靶 向RNA聚合酶I的抗癌化疗药物。 权利要求书1页 说明书4页 附图4页 CN 115261408 A 2022.11.01 CN 115261408 A 1.一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物 的筛选方法， 其特征在于： 依次包括以下 步骤： a)FBL全长ORF基因克隆； b)将FBL全长ORF基因连接pEGFP ‑C1载体得到重组质粒； c)重 组质粒测序验证获取正确质粒； d)正确质粒转染HeLa细胞； e)筛选出能稳定表达EGFP ‑FBL 蛋白的HeLa细胞； f)判断EGFP ‑FBL是否聚集， 否则 转入g步骤， 是则 转入h步骤； g)提示该小 分子不造成核仁应激， 不予考虑， 然后 结束； h)验证45S  pre‑rRNA水平是否降低， 且不影响 GAPDH mRNA转录， 是则转入i步骤， 否则结束； i)筛选出有效抑制RNA聚合酶I的小分子化合 物， 提示为Pol Ii， 然后结束。 2.如权利要求1所述的一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物 的筛选方法， 其特征 在于： 所述d)步骤中采用脂质体转染试剂将正确质粒转染HeLa细胞。 3.如权利要求2所述的一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物 的筛选方法， 其特征 在于： 所述d)步骤中脂质体转染试剂采用L ipofectami ne 2000。 4.如权利要求1所述的一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物 的筛选方法， 其特征 在于： 所述e)步骤中在转染24小时后， 用0.5mg/ml的G418进行筛选， 得到能稳定表达EGFP ‑ FBL蛋白的HeLa细胞。 5.如权利要求1所述的一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物 的筛选方法， 其特征 在于： 所述f)步骤中将能稳定表达EGFP ‑FBL蛋白的HeLa细胞制备成104个/ml的细胞悬液， 以100 μL/孔悬液加入平底、 透明的96孔细胞培养板中， 培养板置于37℃、 5％二氧化碳培养 箱中培养过夜， 直至细胞完全贴壁生长， 用DMSO配制160个小分子化合物溶液， 每孔细胞中 加入一种小分子化合物， 化合物终浓度为20 μM， DMSO浓度不超过0.1％， 处理细胞2小时， 然 后置于荧光显微镜下观察EGFP ‑FBL荧光信号的分布， 以0.1％DMSO处理作为阴性对照， EGFP‑FBL荧光信号呈弥散状， 均匀分布在HeLa细胞核仁中； 以1μM  BMH21处理作为阳性对 照， EGFP‑FBL荧光信号聚集成1个或多个高亮点状信号， 分布于核仁边 缘。 6.如权利要求1至5中任一项所述的一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子化合物的筛选 方法， 其特征在于： 所述h)步骤中采用实时荧光定量PCR分析， 验证细胞45S  pre‑rRNA的水 平是否显著降低， 而GAP DH基因的mRNA转录水平不影响。 7.一种RNA聚合酶I小分子抑制剂的应用， 其特征在于： 将权利要求1 ‑6中得到的RNA聚 合酶I小分子抑制剂用于抗癌化疗药物研发。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115261408 A 2一种靶向抑制RNA聚合酶I的小分子 化合物的筛选方 法及应用 【技术领域】 [0001]本发明涉及一种靶向抑制RNA聚合酶I的小 分子化合物的筛选方法及应用， 属于分 子细胞生物学和生物化学技 术领域。 【背景技术】 [0002]癌症一直是生命健康领域的重大难题， 严重威胁人类健康。 对于晚期癌症患者来 说， 由于肿瘤侵袭远端器官多 数已经无法进 行手术治疗， 只能依靠化疗来 维持生存。 迄今为 止， 已有超过250种抗癌药物被用于临床癌症化疗。 然而， 最常用的一线抗癌化疗药物是抑 制基因组DNA代谢或细胞有丝分裂， 但无法特异性地清除肿瘤细胞。 因此， 长期使用这些化 疗药物会 杀伤正常细胞， 引起严重的副作用， 同时还会造成肿瘤细胞耐药， 导致晚期癌症患 者的死亡。 开发筛 选新型、 靶向肿瘤的抗癌药物的方法具有重要的研发价 值。 [0003]RNA聚合酶I是一类极具潜力的肿瘤治疗靶点。 一方面， 肿瘤细胞由于细胞周期紊 乱， 可以进 行无节制扩增， 而肿瘤细胞的大量增殖必须依靠丰富的核糖体， 以合成增殖所必 需的蛋白质。 而核糖体的合成及 组装依赖于RNA聚合酶I转录的rRNA， 并且几乎在所有肿 瘤 中， RNA聚合酶I的表达水平远高于在正常组织中的表达水平。 所以抑制RNA聚合 酶I的功能， 降低rRNA转录水平， 能阻断细胞核糖体组装， 从而无法提供肿瘤细胞大量增殖所必须的蛋 白质， 发挥肿瘤抑制的作用。 另一方面， 由于很多种癌症细胞都存在DNA损伤 修复的缺陷， 这 些癌症细胞对特定的修复通路的阻断异常敏感。 阻断这些通路会造成DNA损伤修复缺陷的 癌症细胞死亡。 已有研究证实， 在DNA双链断裂的修复过程中， 前体rRNA参与MDC1、 γH2AX、 BRCA1等损 伤修复因子的招募， 抑制 rRNA的转录 能阻断DNA双链断裂过程中foci的形成， 使 得修复因子不能加载至损伤位点， 从而阻断修复的进行， 最终导致细胞基因组不稳定及细 胞凋亡。 筛选RNA聚合 酶I的小分子抑制剂， 抑制rDNA的转录， 从而阻断肿瘤细胞双链断裂修 复， 最终能诱导肿瘤细胞死亡。 因此， 利用小分子化疗 药， 抑制RNA聚合 酶I的转录活性， 一方 面能快速抑制核糖体生物合成， 另一方面阻断细胞 的双链断裂修复通路， 在肿瘤治疗方面 是极具潜质的新型靶标。 因此， 开发灵敏、 高通量的RNA聚合 酶I抑制剂的筛选方法具有重要 的研究价 值。 [0004]rRNA是在RNA 聚合酶I的作用下以rDNA为模板转录而成， 整个过程发生在核仁中。 核仁位于细胞核中， 通常是单一或者多个匀质的球形小体， 呈圆形或椭圆形的颗粒状结构， 无包膜。 核仁具有三层结构， 由内向外包括纤维中心、 致密纤维组分和颗粒组分三部分。 纤 维中心被致密纤维组分包围， 主要成份为rDNA。 致密纤维组分由致密的纤维构成， 是新合成 的rRNA及其结合蛋白的场所。 颗粒组分由核糖核蛋白颗粒构成， 是正在加工成熟的核糖体 亚单位的前体颗粒。 rRNA的加工成熟依赖于rRNA甲基转移酶FBL的作用， 正常情况下， FBL均 匀分布在 核仁中。 当RNA聚合酶I功能异常时， rDNA转录受抑制， 核仁发生应激， 使 得FBL在核 仁中形成1 ‑3个数目不等的聚体， 并转移至核 仁边缘。 本发明利用核 仁应激时， FBL在 核仁中 定位的改变， 筛选出能稳定表达带EGFP荧光信号的FBL蛋白的HeLa细胞。 当用小分子抑制剂 处理细胞时， 在荧光显微镜下观察EGFP荧光信号的定位， 以此判断该小分子是否能特异性说　明　书 1/4 页 3 CN 115261408 A 3