ICS 11.220 B 41 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3257—2020 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体 酶联免疫检测方法 Method of ELISA for PRRSV antibody NEQ 2020 - 04 - 30 发布 辽宁省市场监督管理局 2020 - 05 - 30 实施 发 布 DB21/T 3257—2020 目 前 次 言 ............................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 缩略语 ............................................................................ 1 4 原理 .............................................................................. 1 5 仪器和器材 ........................................................................ 1 6 试剂 .............................................................................. 2 7 操作步骤 .......................................................................... 2 8 试验成立条件与结果判定 ............................................................ 3 9 检测过程中防止交叉污染的措施 ...................................................... 3 10 废弃物处理 ....................................................................... 3 附录 A（资料性附录） 试剂配制 ........................................................ 4 I DB21/T 3257—2020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准由动物卫生标准化技术委员会（辽宁）提出，辽宁省农业农村厅归口管理。 本标准起草单位：辽宁省农业发展服务中心。 本标准协助单位：洛阳现代生物技术研究院有限公司、辽宁佰瑞生物科技有限公司。 本标准主要起草人：周晨阳、魏澍、高志峰、魏园园、王冰、董娜、刘金玲、刘耀川、杨作丰、高 原、王连山、马亮亮、潘婷婷、杨嵘长、姜斌、杨太东、于春玲。 本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址： 辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862； 标准起草单位通讯地址：辽宁省动物及产品检疫中心（沈阳市沈河区万柳塘路105号甲），联系电 话：024-24229579。 II DB21/T 3257—2020 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体酶联免疫检测方法 1 范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体酶联免疫检测方法的技术要求。 本标准适用于在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行猪繁殖与呼吸综合征病毒病的诊断、 监测及流行病学调查，适用于猪血清或血浆样品中的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 19495.2-2004 转基因产品检测 实验室技术要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 ELISA：酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay） PRRSV：猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution） OD：光密度，表示被检测物吸收掉的光密度（optical density） 4 原理 本方法原理是包被板上包被的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗原，可与待测样品中的特异 性抗体反应，形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记的二抗，则形成免疫复合物，洗涤后，如待测样品 中含有PRRSV抗体，显色深，为阳性，反之为阴性。 5 仪器和器材 5.1 微量可调移液器：50 μL～200 μL。 5.2 5mL 采血针管 5.3 冰箱：4 ℃±1 ℃冰箱，-20 ℃±1 ℃冰箱。 5.4 酶标仪 5.5 37 ℃恒温培养箱 5.6 高速台式离心机（离心范围 0～20 000r/min） 5.7 洗板机 5.8 离心管：4 mL 离心管、2 mL 离心管和 1.5 mL 离心管。 1 DB21/T 3257—2020 6 试剂 注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为分析纯或生化试剂；所有试剂均用无 菌的容器分装。 6.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原包被板。 6.2 阳性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性猪血清。 6.3 阴性对照：无猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体猪血清。 6.4 酶标复合物：过氧化物酶标记的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体。 6.5 PBS：磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L pH 7.4）配制见第 A.1 章。 6.6 洗涤液：配制见第 A.2 章。 6.7 样品稀释液：配制见第 A.3 章。 6.8 底物溶液：配制见第 A.5 章。 6.9 终止液：配制见第 A.6 章。 7 操作步骤 注：试验操作过程中涉及生物安全的注意事项依据GB 19489《实验室 生物安全通用要求》的规 定执行。 7.1 样品的采集、前处理与存放 7.1.1 采样注意事项 采集样品及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。 7.1.2 采样工具 5 mL采血针管和4 mL、2 mL和1.5 mL离心管经121±1 ℃高压灭菌20 min。 7.1.3 样品的采集与前处理 采集血液，用离心机分离上清血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染。试验前将被检血清统一 编号，并用样品稀释液作 40 倍稀释。 7.1.4 存放 前处理后的样品密封装于灭菌离心管内，4 ℃或-20 ℃保存或立即检验。 7.2 ELISA 检测 7.2.1 在使用前，所有的试剂盒组份应恢复到 18～26 ℃。试剂应轻轻旋转或振荡混匀。 7.2.2 取出包被板，加入 100 μL 没有稀释的阴性对照和阳性对照，每次检测各加两孔；在相应的孔中 加入 100 μL 已经稀释好的样品。 7.2.3 在 37℃条件下温育 30 min（±1 min）。 7.2.4 将各孔的液体弃入废液桶，用 300 μL 洗涤液洗涤板孔，共洗涤 5 次。每次洗涤后应弃去孔内的 液体。在最后一次洗涤液弃去后，将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干。 7.2.5 每孔加入 100 μL 酶结合物。 7.2.6 在 37℃条件下温育 20 min（±1 min）。 7.2.7 重复步骤 7.2.4。 7.2.8 每孔加入 50 μL 显色液 A 和 50 μL 显色液 B（也可显色液 A、B 等比例混匀后加 100 μL）。 2 DB21/T 3257—2020 7.2.9 在 37℃条件下温育 10 min（±1 min）。 7.2.10 每孔加入 50 μL 终止液，终止反应。测量并且记录样品和对照的 OD 值（450 nm），15 min 内读值有效。 8 试验成立条件与结果判定 8.1 试验成立条件 阴性对照平均值（NC X ） NC X =( NC1+NC2 )/2 阳性对照平均值（PC X ） PC X =( PC1+PC2 )/2 试验成立判断标准：PC X -NC X ≥0.5； NC X ≤0.3。 如果试验无效，试验中的操作值得怀疑，应按照操作说明书重做一次试验。 8.2 结果判定 样品的计算 S/P=(样品－NC X )/( PC X －NC X ) 如果样品 S/P 值＜0.2，样品应判定为抗体阴性。 如果样品 S/P 值≥0.2，样品应判定为抗体阳性。 9 检测过程中防止交叉污染的措施 按照GB/T 19495.2-2004的规定执行。 10 废弃物处理 按照《农业部关于印发〈病死及病害动物无害化处理技术规范〉的通知》（农医发〔2017〕25号) 规定执行。 3 DB21/T 3257—2020 附 录 A （资料性附录） 试剂配制 A.1 磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L pH 7.4） 氯化钠 氯化钾 磷酸二氢钾 十二水磷酸氢二钠 蒸馏水 8g 0.2 g 0.2 g 2.83 g 加至1 000 mL A.2 洗涤液 PBS 1 000 mL 吐温-20 0.5 mL A.3 样品稀释液 含体积分数为10%新生猪血清的洗涤液 A.4 磷酸盐-柠檬酸缓冲液（pH 5.0） 柠檬酸 十二水磷酸氢二钠 蒸馏水 3.26 g 12.9 g 700 mL A.5 底物溶液 用二甲基亚砜3ˊ3ˊ5ˊ5ˊ-四甲基联苯胺（TMB）配成1%质量浓度，4 ℃保存。使用时按下列配方 配制底物溶液。 磷酸盐-柠檬酸缓冲液 9.9 mL 1%3ˊ3ˊ5ˊ5ˊ-四甲基联苯胺 0.1 mL 30%双氧水 1 μL A.6 终止液 浓硫酸 蒸馏水 0.31 mL 100 mL _________________________________ 4