(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210927328.2 (22)申请日 2022.08.03 (71)申请人 中国计量科 学研究院 地址 100013 北京市朝阳区北三环东路18 号 (72)发明人 武利庆　周冬梅　张宁　刘亚辉　 翟睿　杨彬　 (74)专利代理 机构 北京双收知识产权代理有限 公司 11241 专利代理师 窦志梅 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/74(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 基于红外光谱技术的蛋白质纯度计量基准 方法 (57)摘要 本发明的基于红外光谱技术的蛋白质纯度 计量基准方法包括： 初步测定样品中多肽或蛋白 质含量、 制备校准溶液和同位素标记溶液、 对样 品进行衍生化、 对校准溶液进行衍生化和将上述 衍生化后的样品和衍生化后的校准溶液分别进 行气相色谱 ‑红外光谱分析， 计算出样品水解液 中某一种氨基酸的浓度cAA， 并根据cAA计算多肽 或蛋白质的浓度c； 当采用几种氨基酸测定多肽 或蛋白质浓度时， 得到样品水解液中几种氨基酸 的浓度cAA1、 cAA2......和据此计算的几种多肽或 蛋白质的浓度c1、 c2......， 多肽或蛋白质的最 终纯度为上述几种多肽或蛋白质的浓度c的算数 平均值， 本发 明降低了离子抑制和歧视效应等引 入的误差， 提高了测量的准确度。 权利要求书4页 说明书9页 附图8页 CN 115290785 A 2022.11.04 CN 115290785 A 1.一种基于红外光谱技 术的蛋白质纯度计量基准方法， 其特 征在于： 包括如下步骤： (一)、 初步测定样品中多肽或蛋白质含量 用常规的方法， 初步测定出样品中多肽或蛋白质的浓度， 根据 该初测浓度， 计算出其完 全水解后的一种或几种稳定氨基酸的浓度； (二)、 制备 校准溶液和同位素 标记溶液 用0.1mol/L的盐酸溶液分别配制出与样品水解后稳定氨基酸浓度接近的其中一种或 几种稳定氨基酸的校准溶液， 以及对应的同位素标记氨基酸的标记溶液， 得到校准溶液和 同位素标记溶液； (三)、 对样品进行衍 生化 (a)、 在样品中加入同位素 标记溶液并水解 取上述步骤(一)的一定量样品， 在样品中加入与其同体积的步骤(二)中同位素标记溶 液， 准确地称量样品的质量和同位素标记溶液 的质量； 充分混合后采用离心浓缩或氮气进 行吹干， 在吹干的容器中， 按照每100 μg多肽或蛋白质中加入(100～1000)μL的(6～8)mol/L 的盐酸溶液， 用氮气吹扫2min后密封水解容器， 放置到烘箱中于(110～130)℃水解(24～ 96)h， 水解后的溶 液再次采用离心浓 缩或氮气进行吹干， 得到 干态样品混合物； (b)、 采用衍 生化试剂对步骤(a)的干态样品混合物进行衍 生 用甲氧基胺盐酸盐和N,O ‑双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)作为衍生化试剂， 甲氧 基胺盐酸盐和N,O ‑双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)的体积比为1:19， 按照每100 μg多肽 或蛋白质中加入(50～200)μL衍生化试剂的比例， 在上述步骤(a)干态样品混合物中加入 上 述衍生化试剂， 用氮气吹扫1min， 然后放入密封容器， 在(40～90)℃的加热台上衍生化(0.5 ～2)h后， 得到衍 生化后的样品； (四)、 对校准溶 液进行衍 生化 (c)、 在校准溶 液中加入同位素 标记溶液并水解 取上述步骤(二)的一定量校准溶液， 在上述校准溶液中加入与其体积之比为0.8 ‑1.2 的步骤(二)中同位素标记溶液， 分别准确地称量对应的校准溶液质量和同位素标记溶液质 量， 按照上述方式配制出至少五个浓度水平的校准混合溶液； 充分混合后采用离心浓缩或 氮气吹干， 在吹干的容器中， 按照每100μg多肽或蛋白质中加入(100～1000)μL的(6～8) mol/L的盐酸， 再次采用离心浓 缩或氮气进行吹干， 得到 至少五种干态校准混合物； (d)、 采用衍 生化试剂对步骤(c)中干态校准混合物进行衍 生 用甲氧基胺盐酸盐和N,O ‑双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)作为衍生化试剂， 甲氧 基胺盐酸盐和N,O ‑双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)的体积比为1:19， 按照每100 μg多肽 或蛋白质加入(50～200)μL衍生化试剂的比例， 在上述步骤(c)至少五个浓度水平的干态校 准混合物中分别加入 上述衍生化试剂， 用氮气吹扫1min， 然后放入密封容器， 在(40～90)℃ 的加热台上衍 生化(0.5～ 2)h， 得到 至少五个浓度水平的衍 生化后的校准溶 液； (五)、 将上述衍生化后的样品和衍生化后的校准溶液分别进行气相色谱 ‑红外光谱分 析 (e)、 用气相色谱 ‑红外光谱仪对衍 生化后的样品和衍 生化后的校准溶 液进行检测 将上述衍生化后的样品和衍生化后的校准溶液分别装入气相色谱 ‑红外光谱仪的气相 色谱样品瓶中， 进行气相色谱 ‑红外光谱分析， 进样量为(1～2)μL， 在红外谱图(1000～权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 115290785 A 22000)cm‑1的范围内进行采集， 记录流出的色谱图， 并在 色谱图上找到某一种氨基酸的色谱 峰， 提取色谱 峰峰顶区域的红外光谱图,分别记录红外光谱图上衍生化后的样品和 衍生化 后的校准溶 液中的同一种非标记 氨基酸及同位素 标记氨基酸相应峰的峰高或峰面积； (f)、 用衍 生化后的校准溶 液拟合形成校准曲线 将衍生化后的校准溶液中各个浓度水平的某一种非标记氨基酸及同位素标记氨基酸 的峰高或峰面积相比， 得到不同浓度水平衍生化后的校准溶液的峰高比或者峰面积比， 再 将衍生化后的校准溶液中加入的非标记氨基酸和对应同位素标记氨基酸的质量比与上述 相应的峰高或峰面积比进行拟合形成校准曲线； (g)、 计算出样品水解液中氨基酸的浓度cAA 将步骤(e)衍生化后的样品中的同一种非标记氨基酸和同位素标记氨基酸的峰高或峰 面积相比代入到校准曲线中， 得到衍生化后的样品水解液中的同一种非标记氨基酸和同位 素标记氨基酸的质量比mr， 根据样品中加入的同位素标记溶液的质量mL‑AA和样品的质量m， 按照以下公式(6)， 计算出样品水解液中同一种氨基酸的浓度cAA， cAA＝mγmL‑AA/m  公式(6)； 按照以下公式(7)， 计算出多肽或蛋白质的浓度c， 公式(7)中， cAA为水解液中一种氨基酸的浓度， MW为蛋白质的分子量， MWAA为对应的氨基 酸分子量， NAA为一个蛋白质分子中含有的上述对应氨基酸残基的个数； 当采用几种氨基酸测定多肽或蛋白质浓度时， 得到样品水解液中几种氨基酸的浓度 cAA1、 cAA2………， 和以及据此计 算的几种多肽或蛋白质的浓度c1、 c2………， 多肽或蛋白质的 最终纯度为上述几种多肽或蛋白质的浓度的算数平均值。 2.根据权利要求1所述的基于红外光谱技术的蛋白质纯度计量基准方法， 其特征在于： 在所述步骤(a)中， 移取(50～500)μL的样品， 然后用天平称量出移取的该体积样品的质量， 并在其中加入同等体积的上述同位素标记溶液； 采用天平称量上述同位素标记溶液的质 量， 得到样品混合液； 将样品混合液放置在200rpm的摇床上充分混匀(20～60)min后， 放置 到氮气流中， 在50℃的加热台上进行吹干， 在吹干的容器中， 按照每100 μg多肽或蛋白质加 入(100～1000)μL的6mol/L盐酸， 再次用氮气吹扫(2～5)min， 然后放置到密封容器中， 在 (110～130)℃的烘箱中水解(24～96)h， 得到水解后的混合氨基酸溶液； 再次将溶液放置到 氮气流中， 在5 0℃的加热台上吹干， 得到 干态样品混合物。 3.根据权利要求1所述的基于红外光谱技术的蛋白质纯度计量基准方法， 其特征在于： 在所述步骤(c)中， 移取(50～500)μL的校准溶液， 然后用天平称量出移取的该体积校准溶 液的质量， 并在其中加入(0.8 ‑1.2)倍体积的同位素标记溶液； 采用天平分别称量加入的同 位素标记物的质量， 得到至少五个浓度水平校准混合液； 将上述校准混合液分别在200rpm 的摇床上充分混匀(20～60)min后， 分别放置到氮气流中， 在50℃的加热台上分别进行吹 干， 在吹干的容器中， 按照每100 μg多肽或蛋白质分别加入(100～1000)μL的6mol/L盐酸， 再 次用氮气吹扫(2～5)min， 然后分别放置到密封容器中， 在(110～130)℃的烘箱中水解(24 ～96)h， 得到水解后的混合氨基酸溶液； 再次将溶液放置到氮气流中， 在50℃的加热台上吹 干， 得到干态校准混合物。权　利　要　求　书 2/4 页 3 CN 115290785 A 3